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npj Science of Food Band 7, Artikelnummer: 21 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Probiotische funktionelle Produkte erfreuen sich aufgrund ihrer zunehmenden Beliebtheit großer Beliebtheit. Allerdings haben nur wenige Studien den probiotikaspezifischen Stoffwechsel im Fermentationsprozess analysiert. Diese Studie verwendete UPLC-QE-MS-basierte Metabolomik, um Veränderungen im Milchmetabolom im Verlauf der Fermentation durch zwei probiotische Stämme, Lacticaseibacillus paracasei PC-01 und Bifidobacterium jugendlichis B8589, zu verfolgen. Wir beobachteten wesentliche Veränderungen im Metabolom probiotischer fermentierter Milch zwischen 0 und 36 Stunden der Fermentation, und die Unterschiede zwischen den Milchmetabolomen in der Zwischenzeit (36 Stunden und 60 Stunden) und im Reifestadium (60 Stunden und 72 Stunden) waren weniger offensichtlich . Es wurde eine Reihe zeitpunktspezifischer Differenzialmetaboliten identifiziert, die hauptsächlich zu organischen Säuren, Aminosäuren und Fettsäuren gehören. Neun der identifizierten differenziellen Metaboliten stehen im Zusammenhang mit dem Tricarbonsäurezyklus, dem Glutamatstoffwechsel und dem Fettsäurestoffwechsel. Der Gehalt an Brenztraubensäure, γ-Aminobuttersäure und Caprinsäure stieg am Ende der Fermentation an, was zur Nährwertqualität und den funktionellen Eigenschaften der probiotischen fermentierten Milch beitragen kann. Diese Metabolomics-Zeitverlaufsstudie analysierte probiotikaspezifische fermentative Veränderungen in der Milch und lieferte detaillierte Informationen über den probiotischen Metabolismus in einer Milchmatrix und den potenziell vorteilhaften Mechanismus probiotischer fermentierter Milch.

Die Fermentation ist ein Stoffwechselprozess, bei dem organische Stoffe unter der Wirkung von Enzymen vollständig zersetzt werden1. Fermentierte Milch ist eines der wichtigsten fermentierten Lebensmittel und gilt als gesundes Lebensmittel und guter Träger von Probiotika2. Probiotika sind im Darmtrakt, in der Mundhöhle, im weiblichen Fortpflanzungstrakt und sogar in der Schleimhautschicht der Haut weit verbreitet. Probiotische Eingriffe in fermentierte Milch werden weltweit weitgehend von Ärzten, insbesondere Gastroenterologen, unterstützt3. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass probiotische fermentierte Milch den Verbrauchern verschiedene gesundheitliche Vorteile bietet, wie z. B. die Senkung des Serumcholesterins, die Stärkung der Immunantwort, die Verbesserung der Darmgesundheit, die Vorbeugung verschiedener Krebsarten und die Linderung kognitiver Beeinträchtigungen2. Diese Effekte können auf verschiedene funktionelle Komponenten in der probiotischen fermentierten Milch zurückgeführt werden, wie etwa Peptide, Polysaccharide, Fettsäuren, organische Säuren, Vitamine und γ-Aminobuttersäure (GABA)4. Aufgrund seiner gesundheitlichen Wirkung wird Lacticaseibacillus paracasei in der probiotischen Lebensmittelindustrie häufig eingesetzt. Die gesundheitsbezogenen Angaben beschränken sich nicht nur auf die Magen-Darm-Gesundheit, sondern auch auf die Wirtsimmunität, und aktuelle wissenschaftliche Erkenntnisse belegen seine klinische Wirksamkeit bei der Linderung von Munderkrankungen wie Parodontitis und Zahnkaries5,6. Noch wichtiger ist, dass einige Lacticaseibacillus paracasei-Stämme gute Fermentationseigenschaften aufweisen und bei der Lebensmittelfermentation verwendet werden können6,7. Eine weitere Gruppe nützlicher Bakterien sind Bifidobakterien. Die Art Bifidobacterium jugendlichis hat zunehmende Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da sie ein wichtiger Bestandteil der menschlichen Darmmikrobiota ist, der mit der Gesundheit des Wirts zusammenhängt, beispielsweise der Aufrechterhaltung eines gesunden Körpergewichts8 und der Vorbeugung von Verstopfung9. Allerdings lässt sich Bifidobacterium jugendlichis aufgrund seiner geringen Lebensfähigkeit nur schwer für die Fermentation verwenden10. Daher wäre die zusammengesetzte Fermentation von Bifidobacterium jugendlichis mit anderen Stämmen mit guter Fermentationsleistung eine Option, die seine Lebensfähigkeit als Probiotika erhöht.

Einige frühere Studien haben Veränderungen im Metabolom probiotischer fermentierter Milch untersucht, aber die meisten Studien konzentrieren sich nicht auf die Analyse der probiotikaspezifischen Funktion und des Stoffwechsels im Prozess1,11. Streptococcus thermophilus und Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus sind die am häufigsten verwendeten Grundstarterbakterien, die in Kombination mit Probiotika zur Herstellung einer probiotischen Milchfermentation verwendet werden10. Die kombinierte Verwendung dieser traditionellen Starterbakterien mit Probiotika bei der Fermentation macht es jedoch schwierig, die probiotikaspezifischen biochemischen Wirkungen und den Stoffwechsel von denen der traditionellen Starterbakterien zu unterscheiden. Daher wäre es von Interesse, die Einzelwirkung von Probiotika auf das Milchmetabolom zu untersuchen, was Einblicke in den probiotikaspezifischen Stoffwechsel liefern würde. Darüber hinaus kann es aufgrund der kontinuierlichen physiologischen Wirkung lebensfähiger Mikroben auch nach Beendigung der Fermentation zu Reifungsveränderungen im Milchmetabolom probiotischer Produkte kommen. Dies ist bei probiotischen Produkten von besonderer Bedeutung, da eine hohe Lebensfähigkeit der probiotischen Bakterien während und nach der Fermentation für ihre positive Wirkung entscheidend ist. Frühere Studien analysieren jedoch meist nur die Reifungsveränderungen, ohne sich auf die Überwachung der Metabolitenveränderungen während des Milchfermentationsprozesses zu konzentrieren, die auch die Produktqualität und -stabilität widerspiegeln würden11,12.

In dieser Studie wurden zwei probiotische Stämme bei der Milchfermentation eingesetzt, nämlich Lacticaseibacillus paracasei PC-01 (PC-01) und Bifidobacterium jugendlichis B8589 (B8589). Der PC-01-Stamm wurde aus natürlich fermentierter Yakmilch isoliert. Aufgrund seiner guten Fermentations- und probiotischen Eigenschaften wurde es erfolgreich in der fermentierten Milchproduktion eingesetzt13. Der Stamm B8589 wurde aus dem Darm eines gesunden Säuglings isoliert; und es hat eine gute entzündungshemmende und regulierende Wirkung auf die Darmflora14. Darüber hinaus ergab unsere vorherige Studie, dass die kombinierte Verwendung von PC-01 und B8589 bei der Milchfermentation den Gehalt an GABA und kurzkettigen Fettsäuren in der produzierten fermentierten Milch im Vergleich zur alleinigen Verwendung des Stammes PC-01 deutlich erhöhte, was wahrscheinlich zu einer Steigerung führt seine probiotische Funktion13. Daher zielte diese Studie darauf ab, die metabolischen Veränderungen der Milch während der Co-Fermentation und der Reifung der fermentierten Milch weiter zu untersuchen, wenn beide Stämme zusammen als Milchstarter verwendet wurden. Änderungen der Lebendzahl und der Milchmetabolomik wurden mit einem Durchflusszytometer bzw. einer nicht zielgerichteten Metabolomik überwacht (Abb. 1).

Pasteurisierte Milch wurde mit zwei probiotischen Stämmen, Bifidobacterium jugendlichis B8589 und Lacticaseibacillus paracasei PC-01, co-fermentiert. Proben wurden alle 12 Stunden der Fermentation gesammelt, bis der pH-Wert nach 72 Stunden 3,8 erreichte. Die probiotische Lebendzahl in der fermentierten Milch wurde mittels Durchflusszytometrie gezählt. Die Milchmetabolome (bei 0, 36, 60 und 72 Stunden) wurden mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie erfasst, um Veränderungen in Metaboliten und interessierenden Stoffwechselwegen im Verlauf der Milchfermentation zu verfolgen. Abschließend wurde eine Anreicherungsanalyse der identifizierten unterschiedlichen Stoffwechselwege durchgeführt.

Die Anzahl lebensfähiger Zellen der probiotischen fermentierten Milch wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Fermentation mittels Durchflusszytometrie ermittelt (Abb. 2A). Die Anzahl lebensfähiger Zellen erreichte nach 36 Stunden der Fermentation einen Höhepunkt (1,57 × 1010 KBE/ml), der deutlich höher war als nach 0 Stunden (8,49 × 107 KBE/ml; P < 0,001). Sie sank signifikant auf 8,87 × 109 KBE/ml nach 60 Stunden (P < 0,001) und stieg auf 1,57 × 1010 KBE/ml nach 72 Stunden (P < 0,001).

A Veränderungen in der Anzahl lebensfähiger Zellen in der probiotischen fermentierten Milch. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. ***P < 0,001. Unterschiede in der Anzahl lebensfähiger Mikroben zwischen den Zeitpunkten wurden mithilfe der ANOVA auf dem Signifikanzniveau von 95 % (P < 0,05) bewertet. B Bewertungsdiagramm der Hauptkomponentenanalyse der Milchmetabolome zu verschiedenen Zeitpunkten, dh 0, 36, 60 und 72 Stunden der Fermentation. QC-Qualitätskontrollproben.

An den probiotischen fermentierten Milchproben, die nach 0, 36, 60 und 72 Stunden entnommen wurden, wurde eine ungezielte Metabolomik (basierend auf UPLC-QE-MS) durchgeführt. Um die Interpretierbarkeit zu verbessern und unsere Daten zu validieren, wurden eine Hauptkomponentenanalyse und eine orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) durchgeführt, um Veränderungen im Milchmetabolom zu verschiedenen Zeitpunkten sichtbar zu machen. Die Hauptkomponentenanalyse ist ein unbeaufsichtigter Algorithmus für maschinelles Lernen, der die Gesamtvariabilität zwischen Stichproben widerspiegelt. Die x- bzw. y-Achse zeigt die projizierten Stichprobenwerte auf der Ebene, die sich aus der ersten und zweiten Hauptkomponente zusammensetzt, was als Anhaltspunkt für die Ähnlichkeit oder den Unterschied zwischen Stichproben dienen kann. Symbole, die Proben von 0, 36, 60 und 72 Stunden darstellen, zeigten einen deutlichen zeitbasierten Clustering-Trend, und die Qualitätskontrollproben gruppierten sich ebenfalls eng als Gruppe (Abb. 2B), was darauf hindeutet, dass die Gesamtstruktur des Milchmetaboloms von Zeit zu Zeit variierte Punkte und dass die Geräte- und Chromatographiebedingungen stabil und zuverlässig waren.

Anschließend wurden OPLS-DA-Modelle verwendet, um unterschiedliche Markermetaboliten zwischen Zeitpunkten zu identifizieren (0 h gegenüber 36 h; 36 h gegenüber 60 h; 60 h gegenüber 72 h). Die OPLS-DA-Modellierung basiert auf einer überwachten Klassifizierung. Es filtert die orthogonalen Variablen heraus, die nicht mit den kategorialen Variablen der Metaboliten zusammenhängen, und analysiert die nicht-orthogonalen Variablen und die orthogonalen Variablen getrennt, um zuverlässigere Differenzialmetaboliten zwischen Gruppen zu erhalten. Die Score-Plots der OPLS-DA-Modelle sind in Abb. 3A – C dargestellt. Auch hier ist bei jedem paarweisen Vergleich ein klarer zeitbasierter Clustering-Trend zu beobachten. Darüber hinaus bestätigten die Modellparameter für jede Gruppe die Gültigkeit und Genauigkeit der Modelle (0 Stunden gegenüber 36 Stunden: R2Y = 0,999, Q2 = 0,997; 36 Stunden gegenüber 60 Stunden: R2Y = 0,992, Q2 = 0,983; 60 Stunden gegenüber 72). h: R2Y = 0,994, Q2 = 0,988).

A–C Orthogonale Partial-Diskriminanzanalyse-Diagramme der kleinsten Quadrate und D–F-Vulkandiagramme von fermentierten Milchproben. A, D 0 h vs. 36 h; B, E 36 h vs. 60 h; C, F 60 h gegenüber 72 h. Die Vulkandiagramme veranschaulichen die Daten der Milchmetabolomik. Jeder Punkt stellt einen nachgewiesenen Metaboliten dar. Signifikant erhöhte (Sig_Up) und verringerte (Sig_Down) Metaboliten, die durch paarweisen Vergleich zwischen Proben gefunden wurden, werden in Rot bzw. Blau angezeigt (Grenzwert P < 0,05 und Fold Change [FC] >2 oder <0,5). Die signifikanten Schwellenwerte sind durch die schwarzen gepunkteten Linien in den Vulkandiagrammen markiert. Unterschiedliche Metaboliten zwischen Zeitpunkten wurden mithilfe der ANOVA auf dem Signifikanzniveau von 95 % (P < 0,05) bewertet.

Erkannte Metaboliten werden in Vulkandiagrammen visualisiert (Abb. 3D–F), und die Grenzwerte für differenzielle Markermetaboliten waren eine fache Änderung von ˃2 oder <0,05 und P <0,05. Insgesamt wurden 304 unterschiedliche Metaboliten identifiziert (151 erhöht und 153 verringert nach 36 Stunden im Vergleich zu 0 Stunden), von denen 244 durch Datenbanksuchen identifiziert wurden (Ergänzungstabelle 1), darunter 66 Lipide und lipidähnliche Moleküle, 59 organische Säuren und Derivate, 43 organische Sauerstoffverbindungen, 31 Organheterocyclische Verbindungen, 13 Phenylpropanoide und Polyketide, 15 Benzoloide und siebzehn weitere Metaboliten. Einhundertzehn unterschiedliche Metaboliten wurden zwischen probiotischen Milchmetabolomen nach 36 und 60 Stunden identifiziert (43 erhöht und 67 verringert nach 60 h im Vergleich zu 36 h), und 79 dieser differenziellen Metaboliten wurden durch Datenbanksuchen identifiziert (Ergänzungstabelle 1). darunter 21 organische Sauerstoffverbindungen, 20 organische Säuren und Derivate, 17 heterozyklische Organverbindungen, neun Lipide und lipidähnliche Moleküle sowie 12 weitere Metaboliten. Zwischen 60 und 72 Stunden wurden 36 unterschiedliche Metaboliten identifiziert (24 erhöht und 12 verringert nach 72 h im Vergleich zu 60 h), und 27 dieser differenziellen Metaboliten wurden durch Datenbanksuchen identifiziert (Ergänzungstabelle 1), darunter sieben Lipide und Lipide -ähnliche Moleküle, neun organische Sauerstoffverbindungen, fünf organische Säuren und Derivate sowie sechs weitere Metaboliten.

Anschließend haben wir die wichtigsten differenziellen Metaboliten nach chemischer Natur geordnet, um ein besseres Verständnis des biochemischen Prozesses bei der probiotischen fermentierten Milchproduktion zu erlangen (Abb. 4). Zu den vier Haupttypen differenzieller Metaboliten gehörten Lipide und lipidähnliche Moleküle, organische Säuren und Derivate, organische Sauerstoffverbindungen und Organheterocyclen, gefolgt von Phenylpropanoiden und Polyketiden, Benzoiden, Alkaloiden und Derivaten usw. Offensichtlich wurden zwischen den Zeitpunkten (0 Stunden gegenüber 36 Stunden, 36 Stunden gegenüber 60 Stunden und 60 Stunden gegenüber 72 Stunden) unterschiedliche unterschiedliche Stoffwechselprofile (sowohl in Bezug auf die Diversität als auch die Häufigkeit der Metaboliten) gefunden. Um biochemische Veränderungen in verschiedenen Stadien der Milchfermentation weiter zu untersuchen, führten wir selektiv eine Analyse der Stoffwechselweganreicherung an drei Haupttypen von Metaboliten durch (d. h. Lipide und lipidähnliche Moleküle, organische Säuren und ihre Derivate, organische Sauerstoffverbindungen).

Die rosa, grünen und blauen horizontalen Balken stellen die Anzahl der Differenzialmetaboliten (neben/auf den Balken geschrieben) dar, die zwischen 0 und 36 Stunden identifiziert wurden; 36 Std. und 60 Std.; 60 Std. bzw. 72 Std.

Die Analyse der Stoffwechselweganreicherung ist ein wirksames Instrument zur Aufklärung der Mechanismen metabolischer Veränderungen der Proben. Von 0 bis 36 Stunden wurden 25 Stoffwechselwege im Zusammenhang mit organischen Säuren und Derivaten identifiziert, an denen 17 verschiedene Metaboliten beteiligt waren (hauptsächlich Aminosäuren und organische Säuren; Abb. 5A und Ergänzungstabelle 2). Zehn mit Lipiden und lipidähnlichen Molekülen in Zusammenhang stehende Stoffwechselwege wurden angereichert und umfassten neun verschiedene Metaboliten (hauptsächlich Fettsäuren und Glycerophospholipide; Abb. 5B und Ergänzungstabelle 2). Es wurden zehn Stoffwechselwege im Zusammenhang mit organischen Sauerstoffverbindungen identifiziert, an denen 13 verschiedene Metaboliten beteiligt waren (hauptsächlich Kohlenhydrate; Abb. 5C und Ergänzungstabelle 2).

Vergleich zwischen (A–C) 0 h und 36 h; D–F 36 h und 60 h; und G–I 60 h und 72 h. Die angereicherten Wege stehen im Zusammenhang mit organischen Säuren und Derivaten (A, D, G), Lipiden und lipidähnlichen Molekülen (B, E, H) bzw. organischen Sauerstoffverbindungen (C, F, I). Die Farbskala stellt die Konfidenz eines signifikanten Unterschieds (P-Wert) zwischen Probenpaaren dar. Mit dem Wilcoxon-Rangsummentest wurden unterschiedliche Stoffwechselwege nachgewiesen.

Zwischen 36 und 60 Stunden wurden 17 Stoffwechselwege im Zusammenhang mit organischen Säuren und Derivaten identifiziert, an denen 6 verschiedene beteiligt waren (hauptsächlich Aminosäuren und organische Säuren; Abb. 5D und Ergänzungstabelle 2). Drei Stoffwechselwege im Zusammenhang mit Lipiden und lipidähnlichen Molekülen wurden angereichert, wobei zwei verschiedene Glycerophospholipid-Metaboliten beteiligt waren (Abb. 5E und Ergänzungstabelle 2). Es wurden sieben Stoffwechselwege im Zusammenhang mit organischen Sauerstoffverbindungen identifiziert, an denen sieben verschiedene Metaboliten (hauptsächlich Kohlenhydrate; Abb. 5F und Ergänzungstabelle 2) beteiligt sind.

Zwischen 60 und 72 Stunden wurden zwei Stoffwechselwege im Zusammenhang mit organischen Säuren und Derivaten identifiziert, an denen eine organische Säure beteiligt war (Abb. 5G und Ergänzungstabelle 2). Zwei Stoffwechselwege im Zusammenhang mit Lipiden und lipidähnlichen Molekülen wurden angereichert, wobei zwei verschiedene Metaboliten beteiligt waren (hauptsächlich Fettsäuren und Gallensäuren; Abb. 5H und Ergänzungstabelle 2). Es wurden sechs Stoffwechselwege im Zusammenhang mit organischen Sauerstoffverbindungen identifiziert, an denen fünf verschiedene Metaboliten beteiligt sind (hauptsächlich Zucker, Carbonylverbindungen und Alkohole; Abb. 5I und Ergänzungstabelle 2).

Diese Studie verwendete LC-MS-basierte Metabolomik, um die Stoffwechselveränderungen im probiotischen Milchmetabolom zu verschiedenen Zeitpunkten während der komplexen Fermentation durch die Bakterienstämme PC-01 und B8589 zu untersuchen. Durch den Vergleich von Metaboliten zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden einige signifikante unterschiedliche Biomarker identifiziert. Bei diesen Metaboliten handelt es sich hauptsächlich um organische Säuren, Aminosäuren und Fettsäuren, die an wichtigen Stoffwechselwegen wie dem Tricarbonsäurezyklus (TCA), dem Fettsäurestoffwechsel und dem Glutamatstoffwechsel beteiligt sind (Abb. 6). Diese Metaboliten und die Stoffwechselwege, an denen sie beteiligt sind, beeinflussen nicht nur das Wachstum und die Vermehrung der probiotischen Bakterien in der Milchumgebung, sondern beeinflussen auch den Geschmack und die probiotischen Eigenschaften der fermentierten Milch. Stoffwechselwege sind komplex und jeder Weg kann sich über den Rückkopplungsmechanismus der produzierten Metaboliten gegenseitig fördern oder hemmen. Nach unserem besten Wissen wurden die Wechselwirkungen einiger der derzeit gefundenen Metaboliten und die damit verbundenen Stoffwechselwege/spezifischen Auswirkungen bei der Milchfermentation bisher nicht berichtet, was weitere Untersuchungen erfordert. Neun fermentationsstufenspezifische Metaboliten (Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, L-Glutaminsäure, Fumarsäure, GABA, Caprinsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure) trugen erheblich zum unterschiedlich angereicherten Stoffwechsel bei (Abb. 6). Diese Metaboliten kommen in fermentierter Milch allgegenwärtig vor und sind wichtig für deren Qualität und sensorische Eigenschaften.

Die neun Metaboliten (nämlich Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, L-Glutaminsäure, GABA, Palmitinsäure, Ölsäure, Stearinsäure und Caprinsäure) sind in der Stoffwechselkarte (linkes Feld) schwarz geschrieben. Das horizontale Balkendiagramm (rechtes Feld) zeigt die relative Häufigkeit dieser Metaboliten zu verschiedenen Zeitpunkten der Probenentnahme, d. h. 0, 36, 60 und 72 Stunden. CoA-Coenzym A, GABA-γ-Aminobuttersäure, TCA-Tricarbonsäure.

Die meisten Differenzialmetaboliten sind organische Säuren. Die häufigsten organischen Säuren sind Carbonsäuren (R-COOH), und ihre Säure kommt von der Carboxylgruppe (−COOH). Kurzkettige Carbonsäuren sind wichtige chemische Faktoren, die den Geschmack von Milchprodukten beeinflussen. Diese Säuren entstehen durch Lipolyse, Kohlenhydratstoffwechsel und Aminosäurestoffwechsel15. Zu den in dieser Studie gefundenen Biomarker-kurzkettigen Carbonsäuren gehören Bernsteinsäure, Brenztraubensäure und Fumarsäure, die im Stoffwechsel von Milchsäurebakterien entstehen7,16,17.

Pyruvat entsteht durch Zersetzung von Glucose-6-phosphat, das nach der Glucosephosphorylierung durch Hexokinase entsteht18. Es ist das Endprodukt der Glykolyse, das Joghurt ein Essigsäurearoma und einen angenehm säuerlichen Geschmack verleiht. Diese Studie ergab einen signifikanten Anstieg des Pyruvats von 0 auf 36 Stunden, begleitet von einem schnellen Wachstum der Probiotika während dieser Fermentationsphase. Das schnelle Wachstum der Bakterien ist wahrscheinlich auf die anfänglich reichhaltige Glukoseumgebung und einen höheren Pyruvat-Anabolismus als Katabolismus zurückzuführen. Wenn die Fermentation endet, wird die Glukose aufgebraucht und mehr Pyruvat wird in andere nachgeschaltete Metaboliten umgewandelt, wodurch das Bakterienwachstum verlangsamt wird. Pyruvat ist auch eine Vorstufe für Acetyl-CoA, ein wichtiges Substrat des TCA-Zyklus15. Bernsteinsäure und Fumarsäure sind Zwischenprodukte des TCA-Zyklus. Bernsteinsäure mit ihrem sauren, salzigen und bitteren Geschmack ist eines der mitochondrialen Signalmoleküle, das oxidativen Stress und Entzündungsreaktionen in Zellen reguliert19. Fumarsäure ist die einfachste ungesättigte Dicarbonsäure der Natur mit einem fruchtig-säuerlichen Geschmack20. Bernsteinsäure kann durch Succinatdehydrogenase19 zu Fumarsäure oxidiert werden. Ähnlich wie bei Pyruvat wurde in dieser Studie ein signifikanter Anstieg der Bernsteinsäure nach 36 Stunden festgestellt. Allerdings nahm der Gehalt an Fumarsäure mit der Anreicherung von Bernsteinsäure weiter ab und stieg nicht an. Dies kann darauf hindeuten, dass die probiotischen Bakterien Fumarsäure verbraucht haben. Einige Milchsäurebakterien (wie Limosilactobacillus reuteri und Lacticaseibacillus casei) können den TCA-Zyklus in Richtung der Reduktionsreaktion nutzen, d. h. indem sie Fumarsäure zu Bernsteinsäure reduzieren, um das Bakterienwachstum zu fördern21. Darüber hinaus reichert sich Fumarat während des normalen Stoffwechsels nicht übermäßig an und wird durch die Fumarathydratase schnell katalysiert, um Malat zu erzeugen22. Wir haben tatsächlich D-Äpfelsäure als differenziellen Metaboliten nachgewiesen, obwohl dieser nach 36 Stunden im Vergleich zu 0 Stunden nicht signifikant anstieg. Dies könnte ein weiterer Grund für den kontinuierlichen Rückgang der Fumarsäure sein.

Der Stoffwechsel von Aminosäuren steht in engem Zusammenhang mit dem TCA-Zyklus und Aminosäuren sind auch wichtige Produkte des Stoffwechsels von Stickstoffquellen. L-Glutamat und α-Ketoglutarat verbinden den Aminosäurestoffwechsel und den TCA-Zyklus über den GABA-Stoffwechselweg23. Der Stoffwechselweg von GABA ist ein vom TCA-Zyklus abgeleiteter Zweig, bei dem Mikroorganismen L-Glutamat durch Glutamatdecarboxylase direkt und irreversibel decarboxylieren, um GABA24 zu synthetisieren. GABA ist eine Nicht-Protein-Aminosäure mit vier Kohlenstoffatomen, die verschiedene Funktionen hat, wie z. B. Senkung des Blutdrucks, krampflösende Wirkung, Beruhigung der Nerven, Verbesserung von Leber und Nieren, Stärkung der antioxidativen Kapazität des Körpers, Erhöhung der Belastungstoleranz, Verbesserung der Immunfunktion und der Fortpflanzungsfähigkeit25 . Ein fermentativer Weg ist die mikrobielle Umwandlung von Glutamat in GABA, die durch den verringerten pH-Wert während der Fermentation ausgelöst wird26. Unsere Ergebnisse zeigten einen kontinuierlichen Anstieg des GABA-Gehalts, der am Ende der Fermentation seinen Höhepunkt erreichte und mit der Säuerung der fermentierten Milch korrelierte. Gleichzeitig ist GABA auch ein Wachstumsfaktor für einige Bakterien, von dem berichtet wurde, dass er das Wachstum von Probiotika in einigen Fermentationssystemen fördert24. Dies steht im Einklang mit der aktuellen Beobachtung eines aktiven Bakterienwachstums mit einer hohen Lebensfähigkeit von Probiotika. Andererseits verleiht Glutamat in hohen Konzentrationen einen salzigen Geschmack27 und seine Umwandlung in GABA durch Fermentation verbessert die sensorische Qualität der probiotischen fermentierten Milch.

Fettsäuren werden normalerweise durch chemische Prozesse wie Lipolyse, Proteinhydrolyse und Laktosefermentation hergestellt; und der Fettsäurestoffwechsel ist über das Substrat Acetyl-CoA11 mit dem TCA-Zyklus verbunden. Fettsäuren verbessern nicht nur den Geschmack, das Aroma und die Textur des Produkts, sondern haben auch eine physiologische Wirkung auf den Verbraucher. Die wichtigste ungesättigte Fettsäure ist Ölsäure, die 70 % der gesamten ungesättigten Fettsäuren in fermentierter Milch ausmacht28. Ölsäure kann die Blutfette regulieren, den Cholesterinspiegel senken und die Insulinsensitivität verbessern; Es kann auch oxidativen Stress und übermäßige Entzündungsreaktionen bei kritisch kranken Patienten reduzieren29. In mehreren Studien wurde ein Rückgang der Ölsäure in Milchprodukten während der Fermentation festgestellt11,30, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt. Unsere Studie ergab, dass der Gehalt an Ölsäure nach 36 Stunden Fermentation deutlich abnahm, was durch die Umwandlung von Ölsäure in Stearinsäure durch Hydrierung erklärt werden kann11. Tatsächlich beobachteten wir nach 36 Stunden einen Anstieg der Stearinsäure. Epidemiologische Studien haben ergeben, dass die Einnahme verschiedener Fettsäuren unterschiedliche biologische Folgen hat31. Erhöhte Stearinsäurespiegel werden mit einer Senkung des Blutdrucks, einer Verbesserung der Herzfunktion und einer Verringerung des Krebsrisikos in Verbindung gebracht32. Entgegen der landläufigen Meinung, dass gesättigte Fettsäuren schädlich sind, scheint Stearinsäure einige positive Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit zu haben, obwohl der molekulare Mechanismus dieses Phänomens noch unklar ist31,33. Eine weitere häufig in fermentierter Milch nachgewiesene Fettsäure ist Palmitinsäure, die allgemein als ungesund gilt34. In den meisten Studien wurde jedoch nur die Wirkung einer hohen Dosis Palmitinsäure analysiert32,35 und nur eine Studie hat wünschenswerte apoptotische und krebshemmende Wirkungen von Palmitinsäure in probiotischer fermentierter Milch gezeigt36. Obwohl Milchprodukte eine wichtige Nahrungsquelle für Palmitin- und Stearinsäure sind, wird ihr Verzehr mit einem geringeren Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht37. Daher könnte der Anstieg der Palmitin- und Stearinsäure durch Milchfermentation wünschenswert sein, es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die gesundheitlichen Auswirkungen dieser Metaboliten zu bestätigen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Caprinsäurespiegel nach 36 Stunden der Fermentation deutlich anstieg und bis zum Ende der Fermentation auf einem hohen Niveau blieb. Caprinsäure ist eine mittelkettige Fettsäure, die in einigen fermentierten Milchsorten vorkommt und Epilepsie lindert, den Energiestoffwechsel im Gehirn ankurbelt und das Nährstoffmalabsorptionssyndrom lindert38.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie mithilfe von UPLC-QE-MS Momentaufnahmen der Lebensfähigkeit von Bakterien und der Metabolome probiotischer fermentierter Milch zu verschiedenen Zeitpunkten während und nach der Milchfermentation erstellte. Das Metabolom der probiotischen fermentierten Milch veränderte sich zu früheren Zeitpunkten (zwischen 0 und 36 Stunden) stark und zeigte während der Zwischenzeit (zwischen 36 und 60 Stunden) und der Reifung (zwischen 60 und 72 Stunden) nur geringfügige Unterschiede. Zwischen verschiedenen Stadien der probiotischen Milchfermentation wurde eine Reihe unterschiedlicher Metaboliten identifiziert, darunter hauptsächlich organische Säuren, Aminosäuren und Fettsäuren, die am TCA-Zyklus, am Glutamatstoffwechsel und am Fettsäurestoffwechsel beteiligt sind. Neun differenzielle Metaboliten wurden als zeitpunktspezifische differenzielle Biomarker identifiziert und ihre Veränderungen könnten zu der einzigartigen sensorischen und ernährungsphysiologischen Qualität probiotischer fermentierter Milch führen. Einige funktionelle Biomoleküle, z. B. Pyruvat, GABA und Caprinsäure, stiegen am Ende der Fermentation deutlich an, was zu den vorteilhaften Eigenschaften probiotischer fermentierter Milch beitragen könnte. Diese Metabolomics-Studie im zeitlichen Verlauf analysierte probiotikaspezifische fermentative Veränderungen in der Milch und lieferte detaillierte Informationen über den probiotischen Metabolismus in einer Milchmatrix.

Magermilchpulver (NZMP, Wellington, Neuseeland) mit 2 % Glucose wurde in destilliertem Wasser gelöst (50 °C, 30 min). Die Milch wurde homogenisiert (65 °C, 20 MPa) und pasteurisiert (95 °C, 5 Min.), bevor sie auf 20 °C abgekühlt wurde. Für die komplexe Fermentation wurden die Bakterienstämme B8589 und PC-01 verwendet. Bei beiden Stämmen handelte es sich um Probiotika, die von der Lactic Acid Bacteria Culture Collection der Inner Mongolia Agricultural University, China, bereitgestellt wurden. Die Probiotika wurden in die gekühlte pasteurisierte Magermilch geimpft und ihre anfängliche Lebendzahl wurde auf 1 × 107 KBE/ml für PC-01 bzw. 1 × 106 KBE/ml für B8589 eingestellt. Die beimpfte Milch wurde anaerob bei 37 °C fermentiert, bis der pH-Wert nach 72 Stunden 3,8 erreichte. Nach Erreichen eines pH-Werts von 3,8 wurde die probiotische fermentierte Milch bis zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert. Während des Fermentationsprozesses wurden alle 12 Stunden fermentierte Milchproben entnommen. Das Studiendesign ist in Abb. 1 dargestellt.

Die lebensfähige Anzahl probiotischer Bakterien in der fermentierten Milch wurde wie zuvor beschrieben gezählt39. Zwei Farbstoffe, SYTO 9 (5 mM) und Propidiumiodid (PI; 1 mg/ml), wurden jeweils in DMSO (≤1 %) gelöst. Die fermentierten Milchproben wurden auf eine Dichte von 106 bis 107 KBE/ml verdünnt und 980 μl der verdünnten fermentierten Milchproben wurden in vier saubere Röhrchen überführt. In drei der Röhrchen befanden sich 10 μL PI (0,2 mM/L; PI-Einzelfärbung), 10 μL SYTO 9 (0,1 mM/L; SYTO 9-Einzelfärbung) und 10 μL Mischfärbung (SYTO 9, 0,1 mM/L). ; PI 0,2 mM/L; Doppelfärbung) wurden jeweils hinzugefügt. Alle vier Zentrifugenröhrchen wurden 30 Sekunden lang geschüttelt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Aliquote doppelt gefärbter Proben (jeweils 200 μl) wurden mit einer gleichen Menge absolut zählender Mikrokügelchen (Flow Counting Fluorescent Spheres; Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA) zur Analyse auf einem Durchflusszytometer (MoFlo Astrios EQ Cell Sorter) gemischt ; Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA).

Die Lichtquelle des Durchflusszytometers war ein luftgekühlter Argon-Ionen-Laser (Anregungslichtwellenlänge 488 nm; Emissionslichtwellenlänge > 630 nm). Für jede Probe wurden Daten von 500.000 Zellen gesammelt. Als Kontrollen dienten ungefärbte Proben und mit PI fluoreszierend gefärbte Bakterienproben. Es wurden Streupunktdiagramme für die Vorwärtsstreuung gezeichnet und das R1-Gate wurde zur Abgrenzung der Zielzellen eingestellt. Zur Darstellung der Anzahl der SYTO 9-positiven und PI-negativen Bakterien wurde ein Streudiagramm mit 488-513/26-Height-Log als Abszisse und 561-614/20-Height-Log als Ordinate erstellt. Ein Streudiagramm mit 488-710/45-Height-Log als horizontaler Koordinate und 488-SSC-Area als vertikaler Koordinate wurde erstellt, um die absolute Anzahl der Mikrokügelchen zu ermitteln. Gesamtkeimzahl = Zahl lebensfähiger Bakterien/absolute Zahl der Mikrokügelchen × absolute Zahl der Konzentration der Mikrokügelchen × Verdünnungsverhältnis.

Proben (jeweils 100 μl) wurden mit 400 μl Extraktionslösung (Acetonitril:Methanol = 1:1, enthaltend isotopenmarkierte interne Standardmischung) 30 s lang in Eppendorf-Röhrchen gemischt. Die Mischungen wurden 10 Minuten lang auf Eiswasser beschallt, 1 Stunde lang bei –4 °C stehen gelassen und 15 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min (Zentrifugalkraft 13.800 × g, Radius 8,6 cm) zentrifugiert. Die Probenüberstände wurden filtriert und in saubere Probenfläschchen für die Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Analyse (UPLC) mit einem Acquity UPLC (Vanquish, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) überführt, das an einen Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupol gekoppelt war. Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Zur Analyttrennung wurde eine Acquity UPLC BEH Amide-Säule (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) verwendet (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Eine gleiche Menge aller Proben wurde gemischt, um die durchzuführende QC-Probe zusammenzusetzen, um die Stabilität der instrumentellen und chromatographischen Bedingungen sicherzustellen. Die Flüssigchromatographiephasen waren: eine wässrige Phase A, enthaltend 25 mmol/L Ammoniumacetat und 25 mmol/L Ammoniakwasser; Phase B war Acetonitril. Die Gradientenelution wurde wie folgt programmiert: 0–0,5 min, 95 % B; 0,5–7 Min., 95–65 % B; 7–8 Min., 65–40 % B; 8–9 Min., 40 % B; 9–9,1 Min., 40–95 % B; 9,1–12 min, 95 % B. Die Temperatur der Probenschale betrug 4 °C und das Injektionsvolumen betrug 2 μl. Das QE HFX-Massenspektrometer wurde aufgrund seiner Fähigkeit zur Erfassung von MS/MS-Spektren im informationsabhängigen Erfassungsmodus (IDA) bei der Steuerung der Erfassungssoftware (Xcalibur, Thermo) verwendet. In diesem Modus wertet die Erfassungssoftware kontinuierlich das Full-Scan-MS-Spektrum aus. Die Bedingungen der Elektrospray-Ionisationsquelle wurden wie folgt eingestellt: Hüllgasdurchflussrate von 3,35 l/min; Hilfsgasdurchfluss von 16,8 l/min; die Kapillartemperatur von 350 °C; Massenbereich von 70–1050; Scan-/Zykluszeit von 760 ms; volle MS-Auflösung von 60.000; MS/MS-Auflösung von 7500; Kollisionsenergie von 10/30/60 im normalisierten Kollisionsenergiemodus; Sprühspannung von 3,6 kV (Positiv-Ionen-Modus) bzw. 3,2 kV (Negativ-Ionen-Modus).

Die Originaldatendatei wurde von der ProteoWizard-Software in das mzXML-Format konvertiert. Ein selbst geschriebenes R-Paket (XCMS-Kernel) wurde verwendet, um Daten für die Identifizierung, Extraktion, Ausrichtung und Integration von Peaks zu verarbeiten, und eine hauseigene MS2-Datenbank (BiotreeDB) wurde für die Annotation von Metaboliten verwendet.

Unterschiede in der Anzahl lebensfähiger Mikroben zwischen den Zeitpunkten wurden mithilfe von ANOVA auf dem Signifikanzniveau von 95 % (P < 0,05) unter Verwendung von R Version 4.0.4 (R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich) bewertet. Stoffwechselveränderungen zwischen Zeitpunkten wurden mithilfe der Hauptkomponentenanalyse und OPLS-DA visualisiert, die mit dem Online-Tool Metaboanalyt 5.0 (https://www.metaboanalyt.ca) erstellt wurden. Erkannte Metaboliten wurden durch Vulkandiagramme visualisiert und signifikant unterschiedliche Stoffwechselmerkmale wurden entsprechend der Faltungsänderung (Faltungsänderung >2 oder <0,5) und dem P-Wert (P <0,05) ausgewählt. Die Annotation von Stoffwechselwegen und die Anreicherungsanalyse unterschiedlicher Metaboliten wurden unter Verwendung der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes-Datenbank (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) durchgeführt. Ein schematisches Diagramm des Studiendesigns wurde mit dem Online-Tool BioRender (https://app.biorender.com/) erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Wir erklären, dass alle Daten im Zusammenhang mit dieser Studie in diesem Dokument und seinen Zusatzinformationen enthalten sind.

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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (32260572), den Inner Mongolia Science and Technology Major Projects (2021ZD0014), dem zweckgebundenen Fonds für CARS-36 und der Major Project in Natural Science Foundation der Autonomen Region Innere Mongolei finanziert ( Nr. 2020ZD12).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yaru Sun, Shuai Guo.

Schlüssellabor für Milchbiotechnologie und -technik (Inner Mongolia Agricultural University), Bildungsministerium, 010018, Hohhot, China

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang und Jicheng Wang

Schlüssellabor für Milchproduktverarbeitung, Ministerium für Landwirtschaft und ländliche Angelegenheiten, 010018, Hohhot, China

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang und Jicheng Wang

Schlüssellabor für Milchbiotechnologie und -technik der Inneren Mongolei, Landwirtschaftliche Universität der Inneren Mongolei, 010018, Hohhot, China

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang und Jicheng Wang

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YS: Schreiben – Originalentwurf, Untersuchung, Validierung und Visualisierung. SG: Schreiben – Originalentwurf, Untersuchung und Validierung. TW: Untersuchung. JZ: Untersuchung. L.-YK: Schreiben – Rezension und Bearbeitung. ZS: Konzeptualisierung, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. HZ: Konzeptualisierung, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. JW: Konzeptualisierung, Betreuung und Projektverwaltung.

Korrespondenz mit Jicheng Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sun, Y., Guo, S., Wu, T. et al. Ein ungezielter, auf Massenspektrometrie basierender Metabolomics-Ansatz deckt biochemische Veränderungen in zusammengesetzter probiotischer fermentierter Milch während der Fermentation auf. npj Sci Food 7, 21 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

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Eingegangen: 09. Dezember 2022

Angenommen: 15. Mai 2023

Veröffentlicht: 24. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

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