Identifizierung von β-Inhibitoren - Jiaxing Glasdecke Inc.

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 2648 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das biomineralische Hämozoin oder sein synthetisches Analogon β-Hämatin (βH) stand im Mittelpunkt mehrerer zielbasierter Tests auf Aktivität gegen Plasmodium falciparum-Parasiten. Zusammen mit der bekannten βH-Kristallstruktur macht die Verfügbarkeit dieser Screening-Daten das Ziel sowohl für strukturbasiertes als auch ligandenbasiertes virtuelles Screening zugänglich. In dieser Studie wurden molekulare Docking- und maschinelle Lerntechniken, einschließlich Bayesian- und Support-Vector-Machine-Klassifikatoren, nacheinander verwendet, um die in silico ChemDiv 300k-Bibliothek repräsentativer Verbindungen auf Inhibitoren von βH mit beibehaltener Aktivität gegen P. falciparum zu durchsuchen. Wir haben einen priorisierten Satz von Inhibitoren kommerziell erworben und getestet und die Cumarin- und Iminodipyridinopyrimidin-Chemotypen als wirksame In-vitro-Inhibitoren des βH- und Ganzzellparasitenwachstums identifiziert.

Malaria ist eine uralte parasitäre Infektion, die durch fünf virulente Arten der Gattung Plasmodium verursacht wird, von denen Plasmodium falciparum (Pf)1 die tödlichste ist. In den letzten Jahrzehnten hat das Aufkommen antimalariaresistenter Pf-Stämme den einheitlichen Bemühungen zur Bekämpfung der Krankheit entgegengewirkt, und jüngste Berichte über eine teilweise Artemisinin-Resistenz in Ostafrika haben große Besorgnis hervorgerufen2,3. Obwohl die Antimalaria-Forschung zahlreiche Spitzenkandidaten hervorgebracht hat, sind konventionelle Strategien zur Arzneimittelentwicklung wie das Hochdurchsatz-Screening (HTS) bekanntermaßen teuer und mit hohem Risiko verbunden, und neuartige Medikamente gelangen nur langsam auf den klinischen Markt4. In-silico-Screening ist heute eine weit verbreitete Taktik zur Beschleunigung der Arzneimittelentwicklung. Mithilfe strukturbasierter oder ligandenbasierter Methoden können große chemische Bibliotheken virtuell nach Verbindungen durchsucht werden, die am wahrscheinlichsten Aktivität zeigen, was zu erheblichen Anreicherungsraten im Vergleich zum zufälligen Screening führt5.

Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, dass die 4-Aminochinolin-Antimalariamittel, von denen einige aufgrund von Resistenzen in bestimmten Regionen unwirksam geworden sind, durch Hemmung der Hämozoinbildung (HZ) wirken6. Während der asexuellen Blutphase des Plasmodium-Lebenszyklus wird Hämoglobin in der Verdauungsvakuole des Parasiten abgebaut, wobei freies Häm als Nebenprodukt freigesetzt wird. Häm hat die Tendenz, sich in Zellmembranen zu verteilen und katalysiert die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies; Daher hat Plasmodium einen komplexen Mechanismus zur Häm-Entgiftung entwickelt, der die Umwandlung von Häm in inerte HZ-Kristalle beinhaltet. Angesichts der Tatsache, dass die kombinierte Wirksamkeit und die geringen Kosten von Chloroquin (CQ), einem der erfolgreichsten Medikamente dieser Klasse, noch von anderen klinischen Malariamitteln nachgeahmt werden müssen7, besteht großes Interesse an der Entdeckung alternativer HZ-hemmender Chemotypen. Noch wichtiger ist, dass HZ im Vergleich zu anderen validierten Zielen den entscheidenden Vorteil hat, kein Genprodukt zu sein und daher unveränderlich ist. Resistenz gegen HZ-Inhibitoren wird durch Mutationen in Membrantransportproteinen verliehen, die einen Ausfluss des Arzneimittels weg von der Verdauungsvakuole bewirken, und die strukturspezifische Natur dieses Mechanismus verringert die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzresistenz mit chemisch nicht verwandten HZ-Inhibitoren8. Infolgedessen wurde ein durch Detergens vermittelter, biomimetischer Assay zur Quantifizierung der β-Hämatin-Hemmung (synthetisches HZ, βH) entwickelt und für HTS9,10,11 angepasst. Diese Screenings waren erfolgreich bei der Identifizierung wirksamer βH-hemmender Chemotypen, die auf Ganzzell-PF-Kulturen aktiv sind, einschließlich der Benzimidazole, Benzamide und Triarylimidazole12,13,14,15.

Die Kristallstruktur und Morphologie von βH war auch für die Aufklärung der Wirkungsweise der 4-Aminochinoline und anderer βH-hemmender Verbindungen von Bedeutung16. βH besteht aus zentrosymmetrisch verwandten Hämatin-Einheiten ([Fe(III)PPIX]), die über zwei reziproke Eisen-Carboxylat-Bindungen dimerisieren. Die Dimere wiederum stapeln sich über Wasserstoffbrückenbindungen und bilden parallele Stränge aus Porphyrineinheiten17. Buller et al. schlugen eine nichtkovalente Bindungsstelle auf der (001)-Seite vor, die nicht nur die am schnellsten wachsende Seite und damit die effizienteste Stelle für die Hemmung ist, sondern die gewellte Oberfläche auch chemische Gruppen und aromatische Oberflächen freilegt, die die Adsorption von Inhibitoren begünstigen16.

Die Kenntnis der βH-Kristallstruktur und die Verfügbarkeit von HTS-βH-Inhibitionsdaten machen das Ziel sowohl für struktur- als auch ligandenbasiertes virtuelles Screening (S- und LBVS) zugänglich, und tatsächlich haben beide Strategien bereits zuvor sehr vielversprechende Ergebnisse erzielt. Molecular Docking ist ein strukturbasierter Ansatz, der am häufigsten zur Modellierung der Wechselwirkungen zwischen einem kleinen Molekül und einem Protein verwendet wird. Es kann jedoch auf andere Klassen therapeutischer Ziele ausgeweitet werden, bei denen die Struktur bekannt ist18. Eine Reihe arzneimittelähnlicher Verbindungen aus der ZINC15-Datenbank wurde an die βH-Kristallstruktur angedockt und eine kleine Auswahl hochrangiger Verbindungen wurde für experimentelle Tests priorisiert, was zu einer Trefferquote von 20 % für die βH-Hemmung ≤150 µM19 führte. Es ist jedoch nicht garantiert, dass In-vitro-βH-Inhibitoren eine Aktivität gegen Ganzzell-PF zeigen, und die Mechanismen, die der HZ-Hemmung zugrunde liegen, sind noch nicht ausreichend verstanden, um durch Inspektion zu klären, ob ein βH-Inhibitor gegen den Parasiten wirksam sein wird oder nicht. Darüber hinaus gibt es mehrere Faktoren, die die Fähigkeit der Verbindung beeinflussen, auf die Stelle des Häm-Ziels im DV zuzugreifen und sich dort anzusammeln. Daher ist es ungewöhnlich, direkte Korrelationen zwischen der βH-Inhibitionsaktivität und der Gesamtzellaktivität zu sehen20,21. In dieser Hinsicht ist LBVS eine attraktive Strategie zur Erhöhung der Antiplasmodium-Trefferraten. Ligandenbasierte Methoden werden typischerweise in Abwesenheit einer 3D-Zielstruktur eingesetzt und analysieren bekannte niedermolekulare Inhibitoren und versuchen, ihre spezifischen strukturellen und physiochemischen Merkmale mit einer gewünschten biologischen Aktivität zu korrelieren. Quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen, Pharmakophor-Modellierung und Klassifikatoren für maschinelles Lernen sind Arten von ligandenbasierten Methoden, die häufig bei der Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden22. Zuvor wurden Bayes'sche Modelle zur Vorhersage der βH-Hemmung und der Antiplasmodium-Aktivität entwickelt und erzielten Trefferquoten von 25 % bzw. 33 %23.

In dieser Studie verwenden wir einen zweistufigen virtuellen Screening-Workflow, der molekulare Docking- und maschinelle Lernmethoden umfasst, um eine kommerzielle Bibliothek auf βH-Inhibitoren mit beibehaltener Aktivität gegen Pf-Kulturen zu durchsuchen.

Molekulares Andocken wurde verwendet, um die Wechselwirkungsstärke von 25.000 Verbindungen mit der In-silico-βH-Kristallstruktur vorherzusagen (Abb. 1A). Die ChemDiv 300k-Bibliothek repräsentativer Verbindungen wurde zunächst mithilfe der Fünferregel von Lipinski und des internen Scores von OSIRIS DataWarrior24 auf Arzneimittelähnlichkeit gefiltert. Um den Rechenaufwand des virtuellen Bildschirms weiter zu reduzieren, wurde die Funktion „Select Diversity Set“ in DataWarrior verwendet, die einen fragmentbasierten molekularen Deskriptor zur Berechnung der strukturellen Ähnlichkeit verwendet, um einen Satz von 25.000 priorisierten Verbindungen zu erhalten. Mithilfe von Schrödingers LigPrep25 wurden die Liganden für das Andocken vorbereitet, indem eine Energieminimierung durchgeführt und ihre protonierten Zustände bei pH 5 entsprechend dem Säuregehalt der Verdauungsvakuole des Parasiten erzeugt wurden. Anschließend wurden die Liganden mit AutoDock Vina26 angedockt. Ein Grenzwert von –12 kcal mol–1 wurde gewählt, indem die Docking-Scores an eine kubische Funktion angepasst und der Wendepunkt von –12,9 kcal mol–1 auf die nächste ganze Zahl gerundet wurde (ergänzende Abbildung S1A), die 1592 klassifizierte Moleküle (6,4 %) als „Andocktreffer“ oder vorhergesagte βH-Inhibitoren. Die Andockstellungen zeigen, dass Verbindungen, die an der (001)-Seite oder der gegenüberliegenden (00\(\stackrel{\mathrm{-}}{1}\))-Seite binden, stärkere Bindungsaffinitäten aufweisen, was durch das parallele Porphyrin erklärt werden kann Ringe und freie Carboxylgruppen, die für die Bildung von π-π-Stapelwechselwirkungen bzw. Wasserstoffbrückenbindungen zur Verfügung stehen (Ergänzende Abbildung S1B). Darüber hinaus wurden die 25.000 Verbindungen mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA, ergänzende Abbildung S1C) im chemischen Raum kartiert. Dabei zeigte sich, dass die hochrangigen Verbindungen in PC1 im Vergleich zu denen mit schlechteren, weniger negativen Werten negativ verschoben waren. Basierend auf den PC-Beladungen entspricht dies Molekülen mit höheren logP-Werten und mehr aromatischen Ringen (Ergänzungstabelle S1), was die Bedeutung der π-π-Stapelung unterstreicht.

Virtuelles Screening der ChemDiv 300k-Bibliothek repräsentativer Verbindungen und Priorisierung von In-silico-Hits für den Kauf und experimentelle Tests gegen βH und Ganzzellkulturen von Pf. (a) Zusammengefasster Rechenablauf zur Vorhersage der βH-Hemmung und der Antiplasmodium-Aktivität. (b) Ähnlichkeitskarte der 374 aktiven Verbindungen aus dem Trainingssatz (schwarz) und der 404 LBVS-Treffer, die als SVM (S, in Rot), Bayesian (B, in Grün) und Überlappung (O, in Blau) kategorisiert sind ), basierend auf dem/den Modell(en) vorhergesagt haben, dass sie aktiv sind, überlagert im chemischen Raum. Die Karte half bei der Priorisierung eines Satzes von 24 strukturell nicht verwandten Verbindungen, wobei diejenigen Gerüste ausgeschlossen wurden, die zuvor als βH-Inhibitoren untersucht wurden, dh diejenigen, die häufig in den Wirkstoffen des Trainingssatzes vorkommen. (c) Gekaufte Verbindung S4, angedockt an der (001)-Fläche von βH. S4 bildet mehrere π-π-Stapelwechselwirkungen (rosa gestrichelte Linie) mit den parallelen Porphyrinringen und eine (Amin)NH···O(Carboxyl)-Wasserstoffbindung (grüne gestrichelte Linie).

Zwei Klassifizierungsmodelle wurden mit Daten aus früheren Hochdurchsatz-Screenings für βH-Inhibitoren trainiert (Ergänzungstabelle S2) und zur Vorhersage verwendet, welche der Docking-Hits gegen Ganzzellkulturen von Pf aktiv sein würden. Das Support Vector Machine (SVM)-Modell wurde mit LibSVM erstellt, wie es in der KNIME Analytics Platform27,28 implementiert ist. Die Klassenunterscheidungsfähigkeit von vier Kernelfunktionen (linear, polynomial, radiale Basisfunktion, sigmoidal) wurde durch den Aufbau einer fünffachen Kreuzvalidierungsschleife bewertet; Der Trainingssatz wurde in fünf Gruppen aufgeteilt und für jede Iteration wurde eine Gruppe als Testsatz vorgehalten, sodass die Aktivität jedes Moleküls nur einmal vorhergesagt wurde und ein ROC-Score (Receiver Operating Characteristic) für das Modell erhalten wurde. Die lineare Kernelfunktion zeigte die beste Leistung, was bei der Modellierung einer großen Anzahl von Eingabemerkmalen N nicht unerwartet ist. Zu diesen Merkmalen gehörten hier insgesamt 1875 1D-, 2D- und 3D-Moleküldeskriptoren sowie der erweiterte Konnektivitätsfingerabdruck (ECFP6). Der Regularisierungsparameter C, der vor Überanpassung schützt, indem er die Toleranz des Modells für falsch klassifizierte Daten steuert, wurde auf einen Wert von 0,274 optimiert, was zu einem ROC-Score von 0,935 führte (Ergänzungstabelle S3). Für das Bayesianische Fingerabdruckmodell wurde die Leistung verschiedener molekularer Fingerabdrücke bewertet, wobei der Deskriptor der zirkulären funktionalen Konnektivität (FCFP6) den besten ROC-Wert von 0,918 erreichte (Ergänzungstabelle S4). Aufgrund des geringeren Rechenaufwands für die Erstellung von Bayes'schen Modellen im Vergleich zur SVM wurde das Modell hier über eine einmalige Kreuzvalidierungsschleife optimiert, in der Moleküle einzeln als Testsatz vorgehalten wurden.

Mithilfe der optimierten SVM- und Bayesian-Modelle wurden dann die 1592 Docking-Hits auf Antiplasmodium-Aktivität untersucht, wobei insgesamt 404 davon (25 %) als bioaktiv vorhergesagt wurden. Diese wurden kategorisiert als: SVM- und Bayesian-Überlappung (O), nur Bayesian (B) oder nur SVM (S), basierend darauf, welche Modelle vorhergesagt haben, dass sie aktiv sind. Interessanterweise stufte das SVM-Modell das Medikament fälschlicherweise als inaktiv ein, als die Modelle zur Vorhersage der Aktivität der Kontrollverbindung Chloroquin (Ergänzungstabelle S5) verwendet wurden. Dies könnte durch die lange, flexible Seitenkette von Chloroquin an Position 4 des Chinolinrings erklärt werden, die es von den hoch lipophilen, planaren βH-Inhibitoren unterscheidet, die die aktive Klasse im Trainingssatz dominieren. Im Gegensatz dazu sagte das Bayesianische Fingerabdruckmodell korrekt voraus, dass Chloroquin aktiv ist.

Nachdem die Modelle optimiert worden waren, wurden die für den Trainingssatz getroffenen Vorhersagen analysiert, um Unterstrukturen zu identifizieren, die in den jeweiligen Klassen häufig vorkommen (Tabelle 1). Die Bayes'schen Fingerabdruck- und SVM-Modelle erkennen dieselben Fragmente als günstig für die Antiplasmodium-Aktivität, von denen einige einen N-heteroaromatischen Ring umfassen. Auch der Harnstoffanteil ist in der aktiven Klasse deutlich angereichert. Umgekehrt erscheinen das 1,4-Dihydrochinolin-Gerüst und mehrere seiner Derivate häufig in der inaktiven Klasse, ebenso wie die Arylsulfonamide.

Die 404 In-silico-Treffer umfassen insgesamt 73 Gerüste, von denen 41 nicht im Trainingssatz vorhanden sind. Allerdings haben 13 dieser einzigartigen Gerüste zuvor eine Antiplasmodium-Aktivität dokumentiert (Abb. 2 und ergänzende Abb. 2), darunter Pyrido[1,3-d]pyrimidin-4-on und 1,2,4-triazino[5,6]. -b]Indolgerüste, die zuvor als Hämozoin-Inhibitoren identifiziert wurden. Weitere Ziele, die für bestimmte Gerüste vorgeschlagen wurden (Abb. 2), umfassen Desoxyhypusinhydroxylase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Dihydrofolatreduktase, Cysteinprotease und andere Elemente des Häm-Entgiftungswegs sowie die Wirkungsweisen für die übrigen Gerüste sind noch nicht geklärt (Ergänzende Abbildung 2)29,30,31,32,33,34,35.

Von den SVM- und/oder Bayes'schen Klassifizierungsmodellen vorhergesagte bioaktive Gerüste, die nicht im Trainingssatz vorhanden sind, aber eine dokumentierte Aktivität gegen Plasmodium spp. aufweisen. Ihre vorgeschlagenen Ziele sind unten aufgeführt.

Da nicht alle 404 Verbindungen erworben werden konnten, wurden weitere Kriterien eingeführt, um Verbindungen für experimentelle Tests zu priorisieren. Zunächst wurden die Verbindungen nach ihren SVM- und Bayes-Scores eingestuft und die besten Verbindungen untersucht. Diese Gruppe wies eine begrenzte strukturelle Vielfalt auf und wurde insbesondere von Chemotypen mit gut dokumentierter βH-Hemmung und Antiplasmodium-Aktivität dominiert, dh Chinolinen und Benzimidazolen. Daher wurde in OSIRIS DataWarrior24 eine Ähnlichkeitskarte sowohl der LBVS-Treffer als auch der Wirkstoffe aus dem Trainingssatz erstellt (Abb. 1B), um die Auswahl eines strukturell vielfältigen, repräsentativen Satzes von Verbindungen zu unterstützen, der mit neuartigen Chemotypen angereichert wurde. Verbindungen derselben chemischen Klasse unterschieden sich durch ihre In-silico-Bewertungen sowie ihre Andockpositionen, die in Discovery Studio Visualizer36 überprüft wurden. Bevorzugt wurden Verbindungen, die mehrfache π-π-Stapelwechselwirkungen mit den Porphyrinringen des Kristalls und/oder Wasserstoffbrückenbindungen mit den freien Carboxylseitenketten aufweisen, sowie solche, die über zwei Hämatineinheiten an den Kristall andocken, was durch eine Verdrillung erleichtert wird zwischen den beiden aromatischen Einheiten im Molekül (Abb. 1C). Insgesamt wurden 31 Verbindungen gekauft, darunter jeweils acht Verbindungen aus der O- und B-Kategorie, sieben aus der S-Kategorie und acht als „Non-Hits“ eingestufte Verbindungen. Vier davon waren Andocktreffer, die von beiden Antiplasmodium-Modellen als inaktiv vorhergesagt wurden, und die übrigen dockten mit schlechten Werten zwischen –4,5 und –6 kcal mol−1 an die In-silico-βH-Kristallstruktur an (Abb. 3 und Ergänzungstabelle S5).

Grafische Darstellung der rechnerischen und experimentellen Ergebnisse für 31 von ChemDiv erworbene Verbindungen.

Die Verbindungen wurden auf Aktivität gegen βH in einem Konzentrationsbereich von 0–500 µM getestet, wobei die von Carter et al. beschriebenen Detergens-vermittelten und kolorimetrischen Pyridinferrochrom-Methoden zum Einsatz kamen. und Ncokazi bzw. Egan (Ergänzungstabelle S6)9,10. Wie erwartet zeigten die vier Verbindungen, die schlechte Docking-Werte erhielten (−4,5 bis −6 kcal mol−1), bis zu einer Konzentration von 500 µM keine Aktivität gegen βH. Von den 27 als Docking-Hits klassifizierten Verbindungen zeigten 11 IC50-Werte < 150 µM, was einer Trefferquote von 41 % für die βH-Hemmung entspricht. Fünf Verbindungen zeigten IC50-Werte, die mit CQ (16–40 μM) vergleichbar waren, und O3 und I6 zeigten eine überlegene Aktivität mit IC50-Werten von 8 bzw. 11 μM. Neun der elf βH-Inhibitoren wurden als LBVS-Hits klassifiziert (Tabelle 2).

Alle 31 gekauften Verbindungen wurden in Konzentrationen von 1 und 5 µM gegen den CQ-empfindlichen Stamm Pf NF45 getestet, wobei der von Makler et al. beschriebene Parasiten-Laktatdehydrogenase (pLDH)-Assay verwendet wurde (Ergänzungstabellen S7 und S8)35,37. Interessanterweise zeigte eine Verbindung, die sowohl vom SVM- als auch vom Bayes-Modell als inaktiv gegen Parasiten vorhergesagt wurde, bei beiden getesteten Konzentrationen eine moderate Wachstumshemmung (∼ 60 %). Diese Verbindung war kein βH-Inhibitor, daher wirkt sie wahrscheinlich gegen andere biologische Ziele oder über einen anderen Weg. Da die Antiplasmodium-Modelle nur auf βH-hemmende Wirkstoffe trainiert wurden, würde dies erklären, warum keines der Modelle vorhersagte, dass diese Verbindung aktiv sein würde. Von den neun βH-Inhibitoren hemmten acht das Pf-Wachstum bei 5 µM um >50 %. Mit Ausnahme von O5 wurde die Aktivität dieser Verbindungen vollständig durch die Durchführung von Dosis-Wirkungs-Tests gegen die Pf NF54- und CQ-resistenten Pf Dd2-Stämme ermittelt (Ergänzungstabelle S8). Sechs Verbindungen zeigten IC50-Werte ≤ 5 gegen beide Stämme, was einer Gesamttrefferrate von 30 % für die Antiplasmodium-Aktivität entspricht. Darüber hinaus zeigte Verbindung B1 submikromolare Aktivität gegen den Dd2-Stamm und die Verbindungen O3 und S1 zeigten submikromolare Aktivität sowohl gegen den NF54- als auch den Dd2-Stamm (Tabelle 2). Es wird angenommen, dass die primäre Wirkungsweise dieser Verbindungen in der Hemmung der Hämozoinbildung und einer anschließenden Zunahme zytotoxischer Häm- oder Arzneimittel-Häm-Komplexe besteht. Allerdings kann auch die Störung anderer biologischer Wege zu ihrer Aktivität beitragen. Dies würde weitere Untersuchungen von Fall zu Fall erfordern, um die biologischen Mechanismen oder die Beteiligung von Proteinzielen für jede Verbindung zu validieren.

Interessanterweise enthalten die Verbindungen O3 und O8 beide ein Cumarin-Ringsystem. Die strukturelle Vielfalt und Häufigkeit von aus natürlichen Quellen isolierten Cumarinen hat in der Pharmaindustrie besonderes Interesse geweckt. Der Cumarin-Kern gilt als privilegiertes Gerüst, insbesondere da diese Verbindungen antimikrobielle, krebsbekämpfende und antioxidative Aktivitäten gezeigt haben. Neben einigen Cumarin-haltigen Pflanzenextrakten wurden auch synthetische Cumarin-Derivate als potenzielle Antimalariamittel untersucht, wobei der Erfolg meist durch molekulare Hybridisierung erzielt wurde. Beispielsweise wurde festgestellt, dass Chalkon-Triazol- und Ferrocenyl-Oxazin-Cumarine das Pf-Wachstum im niedrigen mikromolaren Bereich hemmen. Die jeweiligen Autoren nennen die Hemmung von Falcipain-2 und die DNA-Bindung als potenzielle Angriffspunkte, wobei die Hämozoin-Hemmung auch für die letztgenannte Serie in Frage kommt38,39. Das Trainingsset enthält insgesamt fünfzehn Cumarine, die alle βH-IC50-Werte < 60 μM aufwiesen, aber gegenüber Ganzzell-Pf-Kulturen inaktiv sind. Es ist interessant, dass beide Antiplasmodium-Modelle trotz des Fehlens dieses Chemotyps im „aktiven“ Trainingssatz zwei experimentell aktive Cumarin-haltige Moleküle identifizierten. Darüber hinaus wurden von den 81 als Docking-Hits klassifizierten Cumarinen weitere 17 vom SVM- und/oder Bayesianischen Modell als aktiv vorhergesagt.

Verbindung S1 enthält den Iminodipyridinopyrimidin (IDPP)-Kern und ist insofern besonders interessant, als das Antimalariapotenzial dieses Gerüsts nur sehr wenig untersucht wurde. In der PubChem BioAssay-Datenbank wird jedoch berichtet, dass S1 gegen Malaria wirksam ist, und es wurde festgestellt, dass es das Parasitenwachstum in der ersten Generation (48-stündige Inkubation) mit einem EC50-Wert von 0,5 µM hemmt (AID 504832). Mehrere Analoga dieser Verbindungen sind ebenfalls in der BioAssay-Datenbank enthalten und zeigten gute bis mäßige Aktivitäten gegen Pf 3D7 und Dd2 (AID 2302 und 2306), obwohl das biologische Ziel und die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen dieser Verbindungsklasse noch untersucht werden müssen. Das IDPP-Gerüst war im Trainingssatz nicht vorhanden. In der Gruppe der 25.000 untersuchten Verbindungen waren 29 IDPPs vorhanden, von denen sieben Docking-Scores ≤ –12 kcal/mol aufwiesen. Davon wurden nur S1 und sein Analogon von beiden Klassifizierungsmodellen als bioaktiv vorhergesagt. Diese unterscheiden sich von den übrigen fünf IDPPs durch das Vorhandensein eines basischen Stickstoffs am Substituenten des Dihydropyridylrings, der bei pH 5 voraussichtlich zu ~ 95 % und bei pH 7 nur zu 15–18 % protoniert ist. Die Wirksamkeit von Chloroquin ist häufig teilweise auf das „pH-Trapping“ zurückzuführen, den Mechanismus, durch den sich das Medikament in der Verdauungsvakuole des Parasiten ansammelt. Es ist möglich, dass das SVM-Modell implizit die Neigung eines Moleküls zum pH-Einfang als wichtig für die Antiplasmodium-Aktivität charakterisierte.

Die moderne Arzneimittelforschung erfolgt zunehmend silico-basiert, um die exorbitanten Kosten herkömmlicher HTS zu senken. Diese Studie nutzt die zuvor gelöste βH-Kristallstruktur und die Fülle öffentlich verfügbarer HTS-Daten, indem sie SB- und LBVS-Techniken kombiniert, um βH-Inhibitoren mit beibehaltener Aktivität gegen Pf zu identifizieren. Dieser zweistufige Arbeitsablauf erzielte im Vergleich zum Zufallsscreening hervorragende Anreicherungsraten für die βH-Hemmung. Insbesondere das Antiplasmodium-SVM-Modell war erfolgreich bei der Identifizierung von drei Verbindungen mit submikromolarer Aktivität gegen Pf. Die Cumarin- und IDPP-Gerüste stellen vielversprechende Ausgangspunkte für die Leitstrukturoptimierung dar und verdienen weitere pharmakologische Untersuchungen.

Ein hierarchisches virtuelles Screening wurde mit der ChemDiv 300k Representative Compounds Library40 durchgeführt; Zuerst durch Filterung nach Drogenähnlichkeit in OSIRIS DataWarrior24. Lipinskis Fünferregel, ein weit verbreiteter Schätzer für die orale Bioverfügbarkeit, wurde angewendet, um Moleküle auszuschließen, die gegen eines der folgenden Kriterien verstoßen: Molekulargewicht ≤ 500 Da, Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungsdonoren ≤ 5, Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren ≤ 10, Octanol- Wasserverteilungskoeffizient (logP) ≤ 5. Der interne „Druglikeness“-Score von DataWarrior wurde als zusätzlicher Filter verwendet, um Moleküle auszuschließen, die < 0 erhielten. Schließlich wurde die Funktion „Vielfalt auswählen“ implementiert, um eine kleine repräsentative Bibliothek von 25.000 zu erhalten Moleküle.

Die gefilterte Bibliothek wurde für das molekulare Docking in Maestro vorbereitet, einer Schnittstelle für die Schrödinger-Rechenplattform41. LigPrep wurde verwendet, um die 2D-Strukturen mit dem OPLS3e-Kraftfeld25 in ihre energieminimierten 3D-Konformere umzuwandeln. Mithilfe von Epik wurden die protonierten Spezies bei einem pH-Wert von 5,0 ± 0,5 erzeugt, basierend auf dem pH-Wert des interessierenden biologischen Ziels, d. h. der Pf-Verdauungsvakuole42.

Unter Verwendung eines modifizierten cvff-Kraftfelds wurde das βH µ-Propianato-Dimer von einer Forschergruppe an der Universität Stellenbosch mit dem BIOVIA Materials Studio-Paket43,44 optimiert. Ein Rezeptormodell, das die dominanten (100), (010) und am schnellsten wachsenden (001) Gesichter ausdrückt, wurde mit derselben Software generiert, indem eine 3 × 3 × 3 „Superzelle“ gezüchtet und als Proteindatenbank (pdb) exportiert wurde ) Datei.

Das Andocken erfolgte im Python Prescription Virtual Screening Tool (PyRx), das mehrere Open-Source-Programme in einer benutzerfreundlichen Oberfläche kompiliert, darunter OpenBabel und AutoDock Vina26. Wie von AutoDock Vina gefordert, wurden alle Rezeptor- und Ligandenstrukturen in das pdbqt-Format konvertiert, eine Erweiterung des pdb-Formats mit definierten Teilladungen (Q) und Atomtypen (T). Im Vina-Zauberer wurde der Suchraum so eingestellt, dass er die gesamte Kristalloberfläche einschließt; Zentrum (x, y, z): (13,5, 22,5, 12) und Abmessungen (x, y, z): (48, 47,5, 43). Jeder Ligand wurde mit einer Vollständigkeit von 8 angedockt und nur der Bindungsmodus mit der niedrigsten Energie wurde beibehalten. Bei der visuellen Prüfung der Docking-Scores wurde eine Vina-Bindungsaffinität von −12 kcal mol−1 als Grenzwert für die Trefferauswahl gewählt, wodurch 1592 Verbindungen als potenzielle βH-Inhibitoren klassifiziert wurden.

Die Antiplasmodium-Modelle wurden in der KNIME Analytics Platform v4.3.327 erstellt. Obwohl KNIME nicht speziell für die Arzneimittelforschung entwickelt wurde, hat die kollaborative Philosophie dazu geführt, dass mehrere Cheminformatik-Plattformen, darunter RDKit und das Chemistry Development Kit (CDK), in die Plattform integriert sind. Zusammen mit der grafischen Benutzeroberfläche im Drag-and-Drop-Stil macht dies KNIME zu einem attraktiven Werkzeug für maschinelles Lernen für Nicht-Experten.

Die Trainingsdaten stammten größtenteils von einem HTS für βH-hemmende Malariamittel, das von der Vanderbilt University (VU) pilotiert wurde15. Es wurden nur βH-Inhibitoren (βH IC50 ≤ 100 µM) einbezogen, die gegen Pf getestet wurden; Moleküle wurden als „aktiv“ (1) angesehen, wenn sie Pf IC50 ≤ 1 µM aufwiesen, und als „inaktiv“ (0), wenn Pf IC50 ≥ 1,5 µM aufwies. Die gleichen Kriterien wurden auf etwa 100 bioaktive Neo- und Isocryptolepin-Derivate angewendet, die von einer Gruppe an der Okayama University (OU)45,46 synthetisiert wurden. Darüber hinaus wurden eine Reihe von Molekülen aus dem Tres Cantos Antimalarial Compounds Set (TCAMS)47 unter Verwendung unveröffentlichter βH-Inhibitionsdaten in das Trainingsset aufgenommen; Diese Moleküle zeigten alle eine βH-Hemmung von ≥ 90 % und wurden als aktiv angesehen, wenn sie das Pf-Wachstum um ≥ 90 % hemmten, jeweils im Vergleich zum Chloroquin-Kontrollmedikament. Der resultierende Satz enthielt insgesamt 1606 Moleküle mit 374 Wirkstoffen (Ergänzungstabelle S2). Für das SVM-Modell wurden die Trainingsmoleküle in LigPrep bei pH 5 ± 0,5 in ihre energieminimierten 3D-Darstellungen umgewandelt und mehrere Protonierungszustände wurden beibehalten, was zu 1707 Dateninstanzen führte.

Mit dem Fingerprints-Knoten des CDK in KNIME wurden fünf Arten molekularer Fingerabdrücke generiert. Darüber hinaus wurden mit der Open-Source-Software PaDEL insgesamt 1875 molekulare Deskriptoren (1D, 2D und 3D) berechnet.

Der C-SVM-Klassifikator wurde mit LibSVM erstellt, einer Open-Source-Bibliothek, deren Lerncode in KNIME28 implementiert ist. Die Eingabemerkmale wurden vorbereitet, indem (a) der ECFP6-Fingerabdruck in eine Reihe von 1024 ganzen Zahlen erweitert und (b) die in PaDEL berechneten 1875 Deskriptoren normalisiert wurden. Da es keine sichere Methode zur Vorhersage gibt, welche Kernelfunktion für einen bestimmten Datensatz die beste Leistung erbringt, wurde jeder in LibSVM implementierte Kernel (linear, polynomial, RBF, sigmoidal) über eine fünffache Kreuzvalidierungsschleife mit geschichteter Stichprobe bewertet. Die relevanten Hyperparameter wurden für jeden Kernel über die Hillclimbing-Methode optimiert, indem eine Parameteroptimierungsschleife eingebaut wurde.

Der Bayesian-Klassifikator wurde unter Verwendung der Fingerprint Bayesian Learner- und Predictor-Knoten erstellt. Im Allgemeinen verwenden Bayes'sche Modelle einen naiven, Laplace-korrigierten Algorithmus, der auf dem Bayes-Theorem der bedingten Wahrscheinlichkeit basiert.

Dabei ist P(A|B) die Wahrscheinlichkeit, dass eine Verbindung bei Vorhandensein eines molekularen Merkmals aktiv ist, P(B|A) die Wahrscheinlichkeit, dass ein Merkmal in einer aktiven Verbindung vorhanden ist, P(A) die Wahrscheinlichkeit dafür Eine Verbindung im Trainingssatz ist aktiv, und P(B) ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Merkmal im Trainingssatz vorhanden ist. Der Klassifikator geht „naiv“ davon aus, dass die Eingabemerkmale unabhängig sind und multipliziert die Wahrscheinlichkeiten der einzelnen Ereignisse. Die Häufigkeit von Merkmalen im Trainingssatz wird jedoch durch die Einführung eines Laplace-korrigierten Schätzers berücksichtigt, sodass die Punktzahl als Summe der korrigierten Schätzer angegeben wird. Es wurden Modelle für fünf im CDK implementierte molekulare Fingerabdrücke erstellt und durch eine einmalige Kreuzvalidierungsschleife ausgewertet, in der Moleküle einzeln festgehalten und anhand der verbleibenden Dateninstanzen klassifiziert werden.

Basierend auf ihren In-silico-Bewertungen, ihrer strukturellen Vielfalt und ihrer Verfügbarkeit wurde ein Satz von 31 Verbindungen gekauft. Die βH-Inhibitionsaktivität der gekauften Verbindungen wurde mit dem von Carter et al. entwickelten Detergens-vermittelten NP-40-Assay untersucht. in 96-Well-Platten10. Der Assay wurde mit der von Ncokazi und Egan9 beschriebenen Pyridin-Ferrochrom-Methode analysiert. Die UV-Vis-Absorption wurde bei 405 nm auf einem Thermo Scientific Multiskan GO-Plattenlesegerät abgelesen und die IC50-Werte wurden durch Auftragen sigmoidaler Dosis-Wirkungs-Kurven in GraphPad Prism v 9.0.0 berechnet. (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Die wachstumshemmende Aktivität der Verbindungen wurde gegen zwei Pf-Stämme getestet: CQ-empfindliche NF54- und CQ-resistente Dd2-Zelllinien. Die Dosis-Wirkungs-Aktivität wurde mit dem pLDH-Assay in 96-Well-Platten gemessen, wie von Makler et al. beschrieben. in 96-Well-Platten37. Die UV-Vis-Absorption wurde bei 620 nm auf einem MultiSkan Go-Plattenlesegerät abgelesen und die IC50-Werte wurden mithilfe einer nichtlinearen Dosis-Wirkungs-Analyse in GraphPad Prism v 9.0.0 bestimmt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind in den Zusatzinformationsdateien oder auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer 5R01AI143521 finanziert. Der Inhalt dieser Veröffentlichung liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder. Diese Arbeit wurde auch von der National Research Foundation und der Harry Crossley Foundation finanziert. Wir danken dem Center for High Performance Computing (CHPC) für die Bereitstellung des Zugangs zur Schrödinger-Rechenplattform.

Fakultät für Chemie, Universität Kapstadt, Rondebosch, 7701, Südafrika

Leah Amod, Roxanne Mohunlal, Nicole Teixeira, Timothy J. Egan und Kathryn J. Wicht

Drug Discovery and Development Center (H3D), Universität Kapstadt, Rondebosch, 7701, Südafrika

Kathryn J. Wicht

Institut für Infektionskrankheiten und Molekulare Medizin, Universität Kapstadt, Rondebosch, 7701, Südafrika

Timothy J. Egan & Kathryn J. Wicht

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LA führte das In-silico-Screening und den NP-40-Assay auf βH-Bildung durch, RM und NT führten den pLDH-Assay auf Parasitenwachstum durch und TJE und KW konzipierten und leiteten die Studie. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Kathryn J. Wicht.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Amod, L., Mohunlal, R., Teixeira, N. et al. Identifizierung von Inhibitoren der β-Hämatin-Bildung mit Aktivität gegen Chloroquin-resistente Plasmodium falciparum-Malariaparasiten mittels virtueller Screening-Ansätze. Sci Rep 13, 2648 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29273-w

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Eingegangen: 30. November 2022

Angenommen: 01. Februar 2023

Veröffentlicht: 14. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29273-w

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