Eine einzigartige Klasse von Zn2+ - Jiaxing Glasdecke Inc.

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4370 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Behandlung mit β-Lactam-Antibiotika, insbesondere Cephalosporinen, ist ein wesentlicher Risikofaktor für eine Clostridioides-difficile-Infektion. Diese Breitbandantibiotika hemmen irreversibel Penicillin-bindende Proteine (PBPs), bei denen es sich um Serin-basierte Enzyme handelt, die die bakterielle Zellwand aufbauen. Allerdings verfügt C. difficile über vier verschiedene PBPs (PBP1-3 und SpoVD), die unterschiedliche Rollen beim Wachstum und der Sporenbildung spielen, und ihre spezifischen Zusammenhänge mit der β-Lactam-Resistenz dieses Krankheitserregers sind noch nicht ausreichend erforscht. Hier zeigen wir, dass PBP2 (von dem bekannt ist, dass es für das vegetative Wachstum essentiell ist) das primäre bakterizide Ziel für β-Lactame in C. difficile ist. PBP2 ist unempfindlich gegenüber einer Cephalosporin-Hemmung, und dies scheint die Hauptgrundlage für die Cephalosporin-Resistenz in diesem Organismus zu sein. Wir bestimmen Kristallstrukturen von C. difficile PBP2, allein und im Komplex mit β-Lactamen, und offenbaren einzigartige Merkmale, darunter ligandeninduzierte Konformationsänderungen und ein Zn2+-Bindungsmotiv im aktiven Zentrum, das die β-Lactam-Bindung und die Proteinstabilität beeinflusst. Das Zn2+-Bindungsmotiv ist auch in C. difficile PBP3 und SpoVD (von denen bekannt ist, dass sie für die Sporulation essentiell sind) sowie in anderen Bakterientaxa, einschließlich Arten, die in extremen Umgebungen leben, und im menschlichen Darm vorhanden. Wir spekulieren, dass dieses thiolhaltige Motiv und sein zugehöriges Zn2+ als Redoxsensor fungieren könnten, um die Zellwandsynthese für das Überleben in widrigen oder anaeroben Umgebungen zu regulieren.

Eine Clostridioides-difficile-Infektion (CDI) ist eine Erkrankung, bei der das anaerobe, sporenbildende Bakterium C. difficile den Dickdarm infiziert und Symptome hervorruft, die von leichtem Durchfall bis hin zu lebensbedrohlicher Kolitis reichen. Da es sich um die häufigste im Krankenhaus erworbene Infektion handelt, ist die Pathogenese von CDI gut verstanden1,2. Zunächst werden Antibiotika für eine nicht zusammenhängende Infektion oder Prophylaxe verabreicht, wodurch die Vielfalt der Darmflora abnimmt. Ohne Konkurrenz im Dickdarm kann sich C. difficile leicht vermehren und dabei Toxine absondern, die zum Zelltod führen. Der Hauptrisikofaktor für CDI sind Breitbandantibiotika, insbesondere solche mit schwacher Wirkung gegen C. difficile und starker Wirkung gegen andere Darmbakterien3. Derzeit weisen Cephalosporine der 3. Generation und Clindamycin das höchste Odds-Ratio für CDI auf (3,20, 2,86), gefolgt von Cephalosporinen der 2. und 4. Generation (2,23, 2,14)4. Weitere Risikofaktoren sind die Behandlungsdauer, das Alter, der allgemeine Gesundheitszustand und die Ernährung. Aktuelle Studien haben insbesondere gezeigt, dass Zn2+-reiche Diäten die Wahrscheinlichkeit und den Schweregrad von CDI erhöhen5,6,7.

Cephalosporine gehören zur Familie der β-Lactam-Antibiotika. Diese Medikamente erreichen ihre bakterizide Wirksamkeit durch die irreversible Hemmung von Penicillin-bindenden Proteinen (PBPs), insbesondere der Transpeptidase (TPase) PBPs, die Zellwand-Peptidoglycan vernetzen. Insgesamt ist ihre enzymatische Aktivität von wesentlicher Bedeutung und die Inaktivierung einzelner TPase-PBPs kann für den Organismus tödlich sein8,9. Im Genom von C. difficile R20291, einem hypervirulenten epidemischen Ribotyp-027-Stamm, gibt es vier annotierte TPase-PBPs: PBP1 (CDR20291_0712), PBP2 (CDR20291_0985), PBP3 (CDR20291_1067) und SpoVD (CDR20291_2544)10,11. PBP1 ist das einzige bifunktionelle PBP (Klasse A), das eine zusätzliche Glykosyltransferase (TGe)-Domäne trägt, die die Zellwand-Glykankette polymerisiert11,12. Im Gegensatz dazu müssen monofunktionelle TPasen (PBPs der Klasse B) wie PBP2, PBP3 und SpoVD mit einer separaten TGase assoziieren, wie sie aus der SEDS-Familie (Shape Elongation Division Sporulation) stammen, um die Glykaneinheiten von Peptidoglycan zu polymerisieren13. Diese vier PBPs sind unter den Hauptklassen von C. difficile hoch konserviert (> 99 % Sequenzidentität, Ergänzungstabelle 1), einschließlich des Referenzstamms 630 und derjenigen, die zu den epidemischen Ribotypen 027, 078 und 106 gehören. Darüber hinaus sind diese vier streng konserviert PBPs, bestimmte C. difficile-Stämme besitzen eine fünfte TPase PBP mit ~42 % Identität zu B. subtilis PBP3. Eine aktuelle Studie ergab, dass PBP1 und PBP2 für das vegetative Wachstum in R20291 essentiell sind, während SpoVD und PBP3 für die Sporogenese essentiell sind11.

Die Cephalosporin-Resistenz bei C. difficile ist gut dokumentiert, der zugrunde liegende Mechanismus blieb jedoch bis zu diesem Zeitpunkt unklar14. Hier verwenden wir eine Kombination experimenteller Techniken, um die molekularen Grundlagen der Cephalosporinresistenz bei C. difficile zu charakterisieren. Dabei identifizieren wir eine einzigartige Rolle von Zn2+ in drei der vier C. difficile TPase PBPs, die eine neue Gruppe von PBPs darstellen, die bisher noch nicht charakterisiert wurden.

Durch den Vergleich der antibakteriellen MHK ausgewählter Mitglieder jeder β-Lactam-Klasse (Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme und Monobactame) stellten wir fest, dass die Resistenz bei Cephalosporinen ausgeprägter ist (MHK > 64 µg/ml), was mit früheren Berichten übereinstimmt15. Nachfolgende biochemische Analysen von gereinigtem PBP1, PBP2 und PBP3 (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1) zeigen, dass PBP1 und PBP2 gegenüber den meisten Cephalosporinen selektiv unempfindlich sind, im Gegensatz zu nicht essentiellem PBP3, das durch alle β-Lactame wirksam gehemmt wird. Im Vergleich zu PBP1 und PBP3 gab es eine signifikante Korrelation zwischen der PBP2-Hemmung und der MHK (r2 = 0,55). Wenn Cephalexin, das keine nachweisbare Hemmung gegen PBP1, PBP2 oder PBP3 aufweist, als Ausreißer weggelassen wird, beträgt der r2-Koeffizient für die PBP2-Hemmung r2 = 0,73 (ergänzende Abbildung 2). In Kombination mit früheren genetischen Analysen11 deuten diese Daten darauf hin, dass PBP2 das Hauptziel ist, über das die meisten β-Lactame ihre bakteriziden Eigenschaften gegen C. difficile erzielen (Abb. 1b). Diese Korrelation zeigt sich auch zwischen den MIC- und PBP2-IC50-Werten für β-Lactame, die einer weiteren Analyse unterzogen wurden (Abb. 1c, ergänzende Abb. 3).

a Ausgewählte β-Lactame wurden bei 25 µM auf ihre Fähigkeit getestet, mit der Bindung des fluoreszierenden Penicillins Bocillin zu konkurrieren. Ihre prozentuale Hemmung wird als Balkendiagramm angezeigt, wobei jede Farbe die Hemmung gegen PBP1 (orange), PBP2 (blau) und PBP3 (grün) darstellt. Die Daten werden als Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten ± SEM angegeben, wobei die Fehlerbalken die SEM darstellen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die antibakterielle Hemmung (MIC) gegen C. difficile ist direkt darunter aufgeführt (mittlere MIC aus drei biologischen Replikaten). Wie man sieht, haben die Cephalosporine, die schlechte Inhibitoren sind, auch eine geringe antibakterielle Wirksamkeit. Der Zusammenhang zwischen antibakterieller Wirksamkeit und biochemischer Hemmung wird im Streudiagramm in Tafel b weiter veranschaulicht, in dem der logarithmische Regressionskoeffizient aufgeführt ist. Der hohe Koeffizient für PBP2 lässt darauf schließen, dass es das Hauptziel von β-Lactamen ist. c IC50-Werte wurden anschließend für mehrere β-Lactame bestimmt, um die chemischen Eigenschaften zu zeigen, die die Hemmung gegen PBP1 und PBP2 erleichtern. Die Seitenkette, die 3'-Abgangsgruppeneinheiten sowie die Penam- und Cephem-Kerne sind in der oberen Reihe eingekreist. Die chemische Veränderung gegenüber dem vorherigen Medikament (von links nach rechts) ist rot gefärbt. Wie gezeigt, scheint der Cephem-Kern mit einer deutlich schwächeren Hemmung gegen PBP1 und PBP2 verbunden zu sein, was jedoch durch chemische Modifikationen der Seitenkette und der 3'-Abgangsgruppe überwunden werden kann. AMP ampicillin, PEN penicillin G, MET methicillin, CLX cloxacillin, PIP piperacillin, IMI imipenem, MEM meropenem, DOR doripenem, ATM aztreonam, LEX cephalexin, CEF cephalothin, CGL cephaloglycin, CXM cefuroxime, CTX cefotaxime, CRO ceftriaxone, CDN cefditoren, CAZ Ceftazidim, BPR Ceftobiprol.

Während PBP1 von einem essentiellen Gen kodiert wird, gab es nur eine schwache Korrelation zwischen der β-Lactam-Hemmung und der antibakteriellen Aktivität (r2 = 0,06), die nur geringfügig höher war als die des nicht essentiellen PBP3 (r2 = 0,01). Da es sich bei PBP1 jedoch um ein bifunktionelles PBP handelt, können Gendeletionen nicht bestimmen, ob seine TPase- oder TGase-Aktivität essentiell ist. Dieses Experiment legt nahe, dass die TGase-Domäne und nicht die TPase-Domäne wahrscheinlich den wesentlichen Bestandteil dieses Enzyms darstellt. Ceftazidim ist insbesondere ein selektiver und wirksamer Inhibitor von PBP1, hat jedoch nur minimale Auswirkungen auf das Wachstum von C. difficile (MHK = 256 µg/ml). Im Gegensatz dazu war Ceftobiprol das wirksamste getestete Cephalosporin (MHK = 2 µg/ml) und ist ein selektiver und wirksamer Inhibitor von PBP2 mit einer Hemmung von etwa 100 % bei 25 µM. Das Hemmprofil dieser beiden Cephalosporine stützt unabhängig voneinander die Hypothese, dass PBP2 das primäre Ziel für β-Lactame ist, während die PBP1-TPase-Domäne für die Wirkung von β-Lactamen wahrscheinlich weniger wichtig ist. Dies würde darauf hindeuten, dass die TGase-Domäne von PBP1 und nicht seine TPase-Domäne für das vegetative Wachstum wesentlich ist.

Mit wenigen Ausnahmen hemmten Cephalosporine sowohl PBP1 als auch PBP2 nur schwach, was uns zu der Hypothese veranlasste, dass der Cephemkern eine schwächere Hemmung dieser Enzyme bewirken könnte. Anschließend haben wir die IC50-Werte von sieben β-Lactam-Arzneimitteln bestimmt, die zwei offene Fragen beantworten würden: 1) ist der Cephem-Kern mit einer schwächeren Hemmung verbunden als solche, die einen Penam-Kern enthalten, und 2) wenn ja, können chemische Modifikationen am 3'-Abgang auftreten Überwinden Gruppe und Seitenkette intrinsische Hemmschwellen? Ein Vergleich von Ampicillin mit Cephalexin, das bis auf den Cephemkern chemisch identisch ist, legt nahe, dass der Cephemkern tatsächlich für die schwächere Hemmung von PBP1 und PBP2 verantwortlich ist (Abb. 1c, ergänzende Abb. 4). Cephalexin ist jedoch untypisch, da ihm eine 3'-Einheit fehlt, die als Abgangsgruppe fungiert, die normalerweise zur Energetik der Cephalosporinbindung beiträgt16. Durch die Bewertung von Cephalosporinen mit unterschiedlichen 3'-Abgangsgruppen (z. B. Cephalogylcin) und Seitenketten (z. B. Cefotaxim) zeigen wir, dass Modifikationen dieser funktionellen Gruppen die Hemmung gegen PBP1 und PBP2 und damit die antibakterielle Wirksamkeit verbessern können (Abb. 1c). Unter ihnen war Ceftobiprol der beste Inhibitor von PBP2 (IC50 = 1,24 ± 0,04 µM) und verfügt über eine einzigartige Aktivität gegen grampositive Bakterien, die PBPs mit niedriger Affinität exprimieren, wie z. B. Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA), Enterococcus faecalis und Streptococcus pneumoniae17 . Bemerkenswerterweise ist die 3'-Vinylgruppe von Ceftobiprol eine schlechte Abgangsgruppe und bleibt nach der Acylierung verbunden. Seltsamerweise hat Cephalexin (MHK = 4 µg/ml) eine ähnliche antibakterielle Wirksamkeit wie Ceftobiprol (MHK = 2 µg/ml), obwohl es keine der sechs getesteten TPasen hemmt, darunter Ldt2 und Ldt3, zwei Enzyme der Cystein-L,D-Transpeptidase Familie, die auch Zellwandpeptide 18, 19, 20 vernetzt (ergänzende Abbildung 5), was darauf hindeutet, dass sie durch kumulative Hemmung nicht essentieller PBPs oder eines anderen Ziels insgesamt eine bakterizide Wirkung erzielen könnte.

C. difficile PBP2 ist mit einem MW von 111,14 kDa eines der größten bekannten PBPs. Daher enthält die Primärsequenz von PBP2 mehrere zusammenhängende Regionen ohne bekannte Homologie. Zum ersten Mal präsentieren wir seine Kristallstruktur mit Ampicillin mit einer Auflösung von 3,0 Å (Abb. 2, erweiterte Datenergänzungstabelle 2). Es ist nicht nur die erste veröffentlichte Struktur eines C. difficile-PBP, sondern unseres Wissens auch das größte bisher veröffentlichte PBP (855 modellierte Reste: 91,37 kDa). Die TPase-Domäne nimmt eine kanonische Penicilloyl-Serin-Transferase-Faltung an, die durch ein fünfsträngiges β-Faltblatt gekennzeichnet ist, das von drei α-Helices umgeben ist. Das aktive Zentrum befindet sich zwischen dem dritten, das KTG-Motiv tragenden Strang des fünfsträngigen β-Faltblatts (PBP-Nummerierung: β3 / insgesamt: β15), einem SXN-Motiv auf der anderen Seite des Kanals (S550-C551-N552) und zwei, nahezu orthogonale α-Helices, die den Boden der schmalen Substratbindungsspalte bilden. Eine dieser α-Helices (α13) bindet über ihr katalytisches S492 kovalent an Ampicillin. Die zweite modellierte Region war die N-terminale Domäne (NTD, Res. 1-110, 241-383) oder „Sockeldomäne“, die eine geringe Sequenzidentität, aber eine mäßige strukturelle Homologie zu anderen TPase-PBPs9,21 aufweist. Die Architektur des NTD ist durch einen „Kopf“ aus drei Helices und einen „Anker“ aus drei β-Strängen gekennzeichnet.

Die Kristallstruktur von PBP2 im Komplex mit Ampicillin bei einer Auflösung von 3,0 Å zeigt drei neue Strukturmerkmale. Dazu gehören ein neuartiges Zn2+-Bindungsmotiv im aktiven Zentrum (unten links), eine geladene, verlängerte Helix, die die β3-β4-Stränge der TPase-Domäne verbindet, die als „Coiled-Coil-Strecke“ bezeichnet wird (unten rechts), und ungefähr fünf parallele α-Helices, der „zentrale helikale Cluster“.

PBP2 hat zwei lange Abschnitte der Primärsequenz ohne bekannte Homologie. Die Kristallstruktur zeigt, dass diese Regionen zwei wohldefinierte und unterschiedliche supersekundäre Strukturen annehmen, die wir als „Coiled-Coil-Stretch“ und „zentraler helikaler Cluster“ bezeichnet haben. Die Coiled-Coil-Strecke (Res. 805–915) ist eine verlängerte Coiled-Coil-Strecke, die orthogonal zur TPase-Domäne liegt (Abb. 2 – unten rechts). Diese Domäne ist äußerst einzigartig, da sie sich zwischen den β3-β4-Strängen der TPase-Domäne befindet und sich von anderen veröffentlichten PBPs unterscheidet, die an dieser Position normalerweise eine unstrukturierte Schleife von etwa 5–20 Resten aufweisen9,21. Der Dreh- und Angelpunkt dieser Anordnung ist eine α-Helix aus 33 Resten. Aliphatische Reste sind an Helix-Helix-Grenzflächen konzentriert, während sich eine große Anzahl geladener Reste hauptsächlich in lösungsmittelexponierten Bereichen befindet, von denen sich die meisten am unteren Ende dieser Helix befinden, was darauf hindeutet, dass sie mit der äußeren Blättchenschicht der Membrandoppelschicht oder a interagieren könnten separates polares Makromolekül. Der „zentrale helikale Cluster“ ist eine Einfügung (Res. 111–240) aus fünf α-Helices und zwei kurzen β-Strängen, die durch eine β-Windung zwischen der 1. und 2. α-Helices des NTD verbunden sind, die zwischen den spiralförmigen Spiralen liegt. Spulendehnung und NTD. Der zentrale helikale Cluster erstreckt sich über den gesamten Kern von PBP2 und bildet Kontakte mit allen drei Unterregionen des Enzyms.

Das vielleicht bemerkenswerteste Merkmal von PBP2 ist ein höchst einzigartiges Zn2+-Bindungsmotiv, das an das aktive Zentrum angrenzt (Abb. 2 – unten links). PBP2 ist normalerweise in der Primärsequenz verborgen und stellt die erste bekannte Instanz eines Zn2+-Bindungsmotivs im aktiven Zentrum in einer Serin-TPase-PBP dar. Das Zn2+-Ion wird von D515, D528, H538 und C551 koordiniert, wobei C551 der X-Rest des hochkonservierten SXN-Motivs ist. Das SXN-Motiv spielt eine wichtige Rolle bei der Substratbindung, was darauf hindeutet, dass das Zn2+-Ion wichtig für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und die Unterstützung der katalytischen Funktion des aktiven Zentrums ist8,9.

Die Entdeckung eines Zn2+ im aktiven Zentrum von PBP2, zunächst durch Röntgenkristallographie (Abb. 2, ergänzende Abb. 6a), wurde anschließend durch native Massenspektrometrie (ergänzende Abb. 6b), Quadrupol-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma, bestätigt (Q-ICP-MS) sowie ein fluorometrisches Zinkquantifizierungskit (Zn2+: Protein = 0,91:1). Q-ICP-MS bietet eine Massenauflösung von ~0,7 amu in einem breiten Massenbereich und kann daher zur eindeutigen Bestimmung der Zn2+-Bindung durch den Nachweis und die Kalibrierung verschiedener Zn-Isotope verwendet werden. Um seine biochemische Rolle zu untersuchen, wurden C551 und D515 zu Ser und Asn mutiert. Diese Mutationen (Cys → Ser und Asp → Asn) wurden entwickelt, um das Zn2+-Ion zu verdrängen, ohne die strukturelle Integrität zu stören oder künstliche Wechselwirkungen innerhalb des aktiven Zentrums zu erzeugen. Tatsächlich führen D515N und C551S zu einem 12-fachen bzw. 120-fachen Abfall der ICP-MS-Intensität, was darauf hinweist, dass die Fähigkeit der Mutanten, Zink zu koordinieren, erheblich beeinträchtigt wird (ergänzende Abbildung 6e). Obwohl WT PBP2 eine Schmelztemperatur (Tm) von 64,45 ± 0,15 °C hat, zeigen C551S- und D515N-Mutanten außerdem ein bi-sigmoidales Entfaltungsmuster mit reduzierter Tm, was darauf hindeutet, dass die Denaturierung nacheinander und unabhängig in zwei separaten Domänen des Proteins (C551S) erfolgt Tm1 = 36,56 ± 0,29 °C, Tm2 = 53,62 ± 0,13 °C; D515N Tm1 = 35,10 ± 0,44 °C, Tm2 = 56,01 ± 0,11 °C; Ergänzende Abbildung 6c). Die veränderten Schmelztemperaturkurven für die C551S- und D515N-Mutanten legen nahe, dass dieses Zn2+-Bindungsmotiv für die strukturelle Stabilität von PBP2 entscheidend ist. Darüber hinaus stellen wir fest, dass sowohl C551S als auch D515N eine verringerte Affinität für das fluoreszierende Penicillin Bocillin aufweisen (PBP2WT K0,5 = 2,95 ± 0,72 μM, PBP2C551S K0,5 = 13,90 ± 1,84 μM, PBP2D515N K0,5 = 16,72 ± 2,72 μM; Ergänzung Abb. 6d), was darauf hindeutet, dass der Verlust dieses Zn2+ indirekt die katalytische Aktivität beeinflusst.

Um die strukturelle Grundlage für die Cephalosporin-Unempfindlichkeit von PBP2 abzugrenzen, haben wir Strukturen von PBP2 in seiner ungebundenen Form (Auflösung 2,8 Å; Abb. 3a) und mit Ceftobiprol (Auflösung 3,0 Å; Abb. 3b) gelöst. Im ungebundenen Zustand ist das aktive Zentrum von PBP2 verschlossen und K797, T798 und G799 des hochkonservierten KTG-Motivs sind verzerrt. Diese Verzerrungen ermöglichen es dem katalytischen Serin, eine unproduktive Position unter dem β3-Strang einzunehmen, wo es eine Wasserstoffbindung mit einem Wassermolekül eingeht, wodurch es unzugänglich wird (Abb. 3a – oberes Feld, ergänzende Abb. 7a, b). Allerdings öffnet sich das aktive Zentrum bei der Bindung von Ampicillin, was dazu führt, dass Substraterkennungsreste 1–2 Å nach außen verschoben werden und das KTG-tragende β3-Faltblatt nach unten verschoben wird, sich versteift und das Wassermolekül verdrängt. Diese Bewegungen legen das katalytische Serin frei und machen es für einen nukleophilen Angriff frei. Die beschriebenen Umlagerungen des aktiven Zentrums bleiben größtenteils im Ceftobiprol-Komplex erhalten (Abb. 3b – oberes Feld, ergänzende Abb. 7c), sie sind jedoch größer als die bei Ampicillin beobachteten, wie z. B. die Position von Y529 und angrenzenden Resten, was mit übereinstimmt die größere Größe des Cephemkerns (Umfang = 9,7 Å gegenüber 8,5 Å in Ampicillin; Abb. 3b). Folglich kann die für die Bindung und Acylierung erforderliche Energiebarriere höher sein und es müssen zusätzliche kompensatorische Wechselwirkungen gebildet werden, um diese Barriere zu überwinden. Ohne mehrfache günstige Wechselwirkungen wie die von Ceftobiprol weisen die meisten Cephalosporine daher vergleichsweise hohe IC50-Werte auf. Während die Konformationsänderungen des aktiven Zentrums von PBP2 signifikant sind, beobachteten wir noch größere (> 5–15 Å) Starrkörpertranslationen außerhalb der TPase-Domäne (Abb. 3a, b – unteres Feld, Abb. 3c). Diese globalen Konformationsänderungen unterscheiden sich zwischen den beiden Komplexen und betreffen Regionen, die wahrscheinlich mit essentiellen akzessorischen Proteinen interagieren, einschließlich des Elongasom-Proteins MreC und einer Transmembran-TGase MrdB der SEDS-Familie (ergänzende Abbildung 8a, b) 22, 23. Interessanterweise breitet sich der mutmaßliche MreC-Bindungsspalt, der am NTD-„Scharnier“ gebildet wird, in verschiedenen Winkeln zwischen dem Ampicillin und den ungebundenen Strukturen aus, wodurch eine hydrophobe Spalte freigelegt wird, die bei Bindung an Ampicillin deutlich schmaler ist (ergänzende Abbildung 8c). Bemerkenswert ist, dass in der Ampicillin-gebundenen Spalte eine Elektronendichte vorliegt, die möglicherweise einem Glycerin entspricht, das in den ungebundenen oder Ceftobiprol-gebundenen Strukturen nicht vorhanden ist. Die einzigartigen Konformationen, die für alle drei Strukturen von PBP2 beobachtet wurden, legen nahe, dass die Besetzung des aktiven Zentrums nicht nur Veränderungen an anderer Stelle im Enzym induziert, sondern dass die chemische Identität des Liganden tatsächlich zu diesen unterschiedlichen Posen beitragen könnte. Es ist möglich, dass diese Bewegungen Wechselwirkungen mit Partnerproteinen fördern oder negativ beeinflussen, abhängig von der Art des besetzenden Liganden, dh Substrat (Peptidoglycan-Peptid) oder β-Lactam. Mittlerweile können auch Wechselwirkungen mit Proteinpartnern die Ligandenbindung im aktiven Zentrum beeinflussen. Ob und wie genau diese Konformationsänderungen zur Regulierung der PBP2-Aktivität beitragen, muss noch untersucht werden. Zusammengenommen sind die signifikanten lokalen und globalen Konformationsänderungen, die durch die Ligandenbindung hervorgerufen werden, für PBP2 höchst einzigartig, selbst im Vergleich zu anderen β-Lactam-unempfindlichen PBPs wie MRSA PBP2A24,25, und bilden die Grundlage für die Aktivitätsregulierung und die intrinsische Resistenz gegen bestimmte β-Lactam-insensitive PBPs. Lactame.

Eine Überlagerung von (a) ungebundenem C. difficile PBP2 (orange) mit der Ampicillin-gebundenen Form (grün) zeigt, dass die β-Lactam-Bindung erhebliche Konformationsänderungen im aktiven Zentrum (oberes Bild) und in peripheren Regionen (unteres Bild) verursacht. Signifikante Bewegungen werden durch Pfeile angezeigt. b Beim Vergleich der komplexen Struktur von Ampicillin (grün) mit Ceftobiprol (lila) finden wir größere Konformationsänderungen im aktiven Zentrum (oberes Bild) und insgesamt (unteres Bild), die mit der größeren Größe des Cephem-Kerns übereinstimmen. c Eine Überlagerung aller drei Strukturen verdeutlicht die globalen Konformationsunterschiede in allen drei Strukturen, wobei die Bewegungen hauptsächlich auf die Coiled-Coil-Strecke, den zentralen Helix-Cluster und die NTD beschränkt sind.

Obwohl bestimmte Metallo-β-Lactamasen und Carboxypeptidasen für die Katalyse auf Zn2+ angewiesen sind, wurde vor unserer Charakterisierung von C. difficile PBP226,27 noch nie ein Zn2+ im aktiven Zentrum in einer Serin-TPase-PBP gefunden. Die Entdeckung dieses Zn2+ im aktiven Zentrum und die anschließende Entschlüsselung der koordinierenden Reste in der Primärsequenz führten zur Identifizierung anderer Zn2+-bindender PBPs. Bemerkenswert ist, dass dieses Zn2+-Bindungsmotiv zusätzlich zu C. difficile PBP2 auch in C. difficile PBP3 und SpoVD vorhanden ist, was bedeutet, dass drei der vier TPase-PBPs und alle drei Klasse-B-PBPs in C. difficile dieses Motiv aufweisen. Dieses Motiv wurde auch in SpoVD von mehreren anderen Modellfirmicutes wie Bacillus subtilis und Clostridium perfringens gefunden (Abb. 4a). Das Vorhandensein von Zn2+ in C. difficile PBP3, C. difficile SpoVD und B. subtilis SpoVD wurde anschließend durch native Massenspektrometrie sowie Q-ICP-MS bestätigt (ergänzende Abbildung 9). Wie PBP2 bestehen die vier Reste im Zn2+-Bindungsmotiv von C. difficile PBP3 und SpoVD aus einem invarianten His, einem Cys aus dem X-Rest des SXN-Motivs und zwei elektronenreichen Resten – in diesem Fall Cys anstelle von Asp. Sie ähneln auch stark den koordinierenden Resten des klassischen Cys2His2-Zinkfingers, der mit hoher Affinität an Zn2+ bindet28. Die starke Bindung von Zn2+ in den PBPs von C. difficile wird durch die Beobachtung gestützt, dass die PBP2-Aktivität durch 2 mM EDTA nicht beeinträchtigt wurde, und legt nahe, dass sein Vorhandensein in diesen Proteinen wahrscheinlich kein Artefakt der Proteinexpression und -reinigung in Escherichia coli ist.

Ein Mehrfachsequenz-Alignment deckt eine konservierte Zn2+-koordinierende Tetrade in C. difficile PBP2, PBP3, SpoVD und anderen sporenbildenden Firmicutes wie Bacillus subtilis (Bs) und Clostridium perfringens (Cp) SpoVD auf. b Die Kristallstrukturen von C. difficile PBP3 (Cyan) und SpoVD (Lachs) bei einer Auflösung von 2,40 Å und 2,20 Å zeigen eine gemeinsame Faltung und ein Zn2+-Bindungsmotiv.

Als nächstes bestimmten wir die Strukturen von PBP3 und SpoVD mit einer Auflösung von 2,40 Å und 2,20 Å (Abb. 4b). Sowohl SpoVD als auch PBP3 besitzen eine kanonische PBP-Faltung der Klasse B, die Pseudomonas aeruginosa und E. coli PBP329,30 sehr ähnelt. Wichtig ist, dass wir feststellen, dass Zn2+ auf nahezu identische Weise bindet wie PBP2 (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass Asp und Cys an der ersten und zweiten Position austauschbar sind. Die Bedeutung der Asp → Cys-Substitution zwischen SpoVD/PBP3 und PBP2 ist unklar. Während das redoxempfindliche Cystein im SXN-Motiv für PBP2 potenziell als Sensor für den Sauerstoffgehalt in der Umgebung fungieren kann, kann der Ersatz von Asp durch Cys in beiden sporulationsspezifischen PBPs (PBP3 und SpoVD) die Empfindlichkeit weiter erhöhen und/oder sie einem Risiko aussetzen zusätzliche Regelung. Frühere Studien an B. subtilis SpoVD haben gezeigt, dass dieses Motiv, von dem vorhergesagt wurde, dass es sich um eine Disulfidbindung handelt, mit der B. subtilis-Oxidoreduktase StoA interagiert, was darauf hindeutet, dass es als einzigartiger Regulierungsmechanismus für die PBP-Aktivität fungieren könnte31.

Um das Vorhandensein von Zn2+-bindenden PBPs in einem breiteren Spektrum von Bakterienarten zu untersuchen, wurde ein Hidden-Markov-Modell (HMM) basierend auf den unmittelbar flankierenden Sequenzen des Zn2+-bindenden Motivs verwendet, um die UniProt-Datenbank (www.uniprot.org) zu untersuchen. . Insgesamt wurden über 5.000 PBPs entnommen, die das Zn2+-Bindungsmotiv enthielten, und ein Kontrollsatz von über 5.000 PBPs ohne das Zn2+-Bindungsmotiv wurde für die Taxa-Verteilungsanalyse verwendet (Supplementary Data 1). Die überwiegende Mehrheit der Bakterien, die dieses Motiv tragen, gehört zum Stamm der Firmicutes und die meisten sind Anaerobier (Abb. 5a). Zu den repräsentativen Arten gehören solche aus extremen Umgebungen wie Tiefseequellen (Caminicella sporogenes), Ölfeldern (Hungateiclostridium thermocellum), Vulkanasche und heißen Quellen (Heliobacterium Modesticaldum)32,33,34, was darauf hindeutet, dass Zn2+-bindende PBPs Überlebensvorteile bringen könnten widrige Bedingungen, insbesondere anoxische. Als nächstes wurde eine Reihe phylogenetisch unterschiedlicher PBPs basierend auf den PFAM-Samen-PBP-Domänensammlungen (Transpeptidase; PF00905) ausgewählt, um das Evolutionsmuster von Zn2+-bindenden PBPs zu untersuchen (Supplementary Data 2). Unerwarteterweise stellen wir fest, dass sich das Zn2+-Bindungsmotiv unabhängig durch konvergente Evolution aus der alten PBP-Superfamilie entwickelt hat, wie die vier Kladen im Stammbaum zeigen (Abb. 5b). Interessanterweise gibt es in der PBP2-Klade zwei Proteine ohne Zn2+-Bindungsmotiv, was darauf hindeutet, dass es in einer relativ kurzen Evolutionsspanne gewonnen oder verloren werden kann. Beispielsweise teilt Caminicella sporogenes, ein anaerobes, gramnegatives Bakterium, das aus einem Tiefseeschlot isoliert wurde, einen ähnlichen Satz von PBPs (PBP2, PBP3 und SpoVD) mit C. difficile (Abb. 5c). Obwohl C. sporogenes PBP3 und SpoVD ein Zn2+-Bindungsmotiv besitzen, ist dies bei seinem PBP2-Ortholog (Uniprot A0A1M6LWF5_9CLOT) nicht der Fall, trotz seines hohen Sequenzidentitäts-/Ähnlichkeitswerts (41,2 %/60,3 %), wie durch die BLOSUM62-Matrix definiert und vorhergesagt strukturell , Ähnlichkeit mit C. difficile PBP2 (Ergänzende Abbildung 10). Dieser Grad an Homologie legt nahe, dass C. sporogenes PBP2 durch eine oder zwei Mutationen die Fähigkeit zur Zn2+-Bindung erwerben kann. Da PBP2 von C. difficile am vegetativen Wachstum beteiligt ist und PBP3/SpoVD die Sporulation erleichtert, kann das Zn2+-Bindungsmotiv je nach spezifischem Bakterium und natürlichem Lebensraum für verschiedene biologische Prozesse erforderlich sein.

Bemerkenswert ist, dass Bakterien, die Zn2+-bindende PBPs innerhalb der PBP2-Klade enthalten, ausschließlich anaerob sind. In Anbetracht der Tatsache, dass Cysteinreste, einschließlich derjenigen, die an der Zn2+-Bindung beteiligt sind, an der Redoxerkennung in anderen Proteinen beteiligt sind35,36, nehmen wir an, dass die Zn2+-bindenden PBPs als Regulierungsmechanismus fungieren könnten, der bei Konfrontation die Zellwandsynthese stoppen oder die Sporulation fördern kann mit molekularem Sauerstoff und/oder reaktiven Sauerstoffspezies, in Verbindung mit den zuvor untersuchten Reaktionen auf Transkriptionsebene37. Diese Hypothese wird teilweise durch die oben erwähnte Beobachtung gestützt, dass B. subtilis SpoVD durch die Oxidoreduktase StoA31 reguliert wird. Da viele Antibiotika darüber hinaus zumindest einen Teil ihrer bakteriziden Wirkung durch reaktive Sauerstoffspezies erzielen38, können solche Mechanismen möglicherweise zur Antibiotikaresistenz bei Bakterien wie C. difficile beitragen.

Rot zeigt eine Anreicherung von Zn2+-bindendem PBP an, Blau zeigt das Fehlen von Zn2+-bindendem PBP an. a Über 10.000 PBPs wurden analysiert und Zn2+-bindende Motive mit einem speziell entwickelten Hidden-Markov-Modell (HMM) identifiziert. Die Kreisgröße gibt die Anzahl der Arten an. Für Firmicutes sind repräsentative Arten aufgeführt. b Strukturell unterschiedliche Mitglieder der PBP-Superfamilie aus verschiedenen Taxa wurden verwendet, um einen Maximum-Likelihood-Baum zu erstellen, der zeigte, dass Zn2+-bindende PBPs durch konvergente Evolution in der alten PBP-Superfamilie entstanden sind. Diese PBPs haben sich mehrfach aus unabhängigen Kladen entwickelt. Bootstrap-Werte werden neben den Zweigen aufgelistet. c C. difficile und das gramnegative Tiefseebakterium C. sporogenes teilen sich den gleichen Satz von PBP-Proteinen, von denen zwei (SpoVD- und PBP3-Homologe) Zn2+-Bindungsmotive tragen.

Mehrere Hinweise deuten darauf hin, dass Zn2+ über die Nahrung den Schweregrad und die Wahrscheinlichkeit von CDI erhöht5,39, aber die pleiotrope Rolle von Zn2+ hat den genauen Mechanismus verschleiert, durch den es die Pathogenese erleichtert. Jüngste Studien haben ergeben, dass Calprotectin, ein Protein, das vom Immunsystem als Reaktion auf Darmentzündungen ausgeschüttet wird, das Wachstum von C. difficile hemmt6. Interessanterweise ist Calprotectin ein Chelator zweiwertiger Kationen wie Ca2+ und Zn2+. Unter Verwendung von Calprotectin und dem sechszähnigen Liganden TPEN zeigen wir, dass die Sporulation bei 10 µg/ml bzw. 12,5 µM deutlich gehemmt wird (Abb. 6a). Dieser Antisporulationseffekt wird durch die Ergänzung des Mediums mit Zn2+ umgekehrt, was darauf hindeutet, dass er spezifisch für Zn2+ ist, auch wenn er mit Sicherheit nicht auf die PBP-Aktivität beschränkt ist. Das konsistente Vorhandensein eines Zn2+-Motivs in allen drei C. difficile-PBPs der Klasse B (PBP2, PBP3 und SpoVD) und seine offensichtliche Bedeutung für die enzymatische Aktivität und Sporulation legen nahe, dass Zn2+ möglicherweise in einzigartiger Weise mit dem Wachstum der vegetativen Zelle und der Sporen assoziiert ist. Kortex. Darüber hinaus könnten sich diese PBPs entwickelt haben, um die anaerobe Umgebung des Dickdarms zu nutzen, die reich an ausgeschiedenen Spurenmetallen wie Zn2+40 ist. Obwohl Zn2+ wahrscheinlich mehrere wichtige Rollen beim Wachstum von C. difficile spielt, beeinflusst es zumindest die Sporulation und kann zum Zusammenhang zwischen CDI und der Zn2+-Konzentration im Dickdarm beitragen. Andere antisporulierende Mittel umfassen Cephamycine, eine Klasse von Cephalosporinen, die die enzymatische Aktivität von SpoVD41 hemmen. Da PBPs eine wesentliche Rolle bei der Bildung des Sporenkortex spielen, stellten wir die Hypothese auf, dass neben Cephamycinen auch alle β-Lactam-Antibiotika die Sporulation reduzieren sollten. Hier zeigen wir, dass Ampicillin (Sporulations-IC50 oder sIC50, 0,39 ± 0,05 µM) und Meropenem (sIC50 0,75 ± 0,04 µM) in vitro wirksamer sind als Cefoxitin (sIC50 8,80 ± 1,75 µM) (Abb. 6b). Obwohl die Verwendung von β-Lactamen zur Hemmung der Sporulation von C. difficile nicht praktikabel ist, können sie gegen andere Krankheitserreger wie C. perfringens und Bacillus anthracis einzigartig wirksam sein. Dennoch sind SpoVD und PBP3 sehr vielversprechende Angriffspunkte für Medikamente. Ein selektiver, nicht bakterizider Inhibitor dieser Enzyme könnte mit dem Standardbehandlungsschema kombiniert werden und so die Wahrscheinlichkeit einer wiederkehrenden Infektion und Übertragung im Zusammenhang mit der Sporenbildung verringern.

a Antisporulationswirkung des chemischen Chelators TPEN und des biologischen Chelators Calprotectin, einem Protein des angeborenen Immunsystems. Diese Hemmung kann durch die Wiederherstellung von Wachstumsmedien mit Zn2+ rückgängig gemacht werden. Es wurden vier biologische Wiederholungen durchgeführt. Die Daten zwischen zwei Gruppen wurden mit dem ungepaarten Student-T-Test auf statistische Signifikanz analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p < 0,05 (*) vs. R20291, p < 0,01 (**) vs. R20291, und nicht signifikant, wenn sie nicht ausgewiesen wurden. b Alle drei Hauptklassen von β-Lactamen – Ampicillin (Penicilline), Meropenem (Carbapeneme) und Cefoxitin (Cephalosporine) – wurden bei Konzentrationen unterhalb der MHK (½ MHK) untersucht. Dabei zeigte sich, dass diese Antibiotika starke Sporulationshemmer sind (angezeigt durch die Sporulations-IC50). oder SIC50) durch Hemmung von PBPs, die für den Sporenkortexaufbau erforderlich sind, wie PBP3 und SpoVD. Für jede Konzentration wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und jeder Datenpunkt wird als Mittelwert ± SEM dargestellt, wobei Fehlerbalken die SEM darstellen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unabhängig davon sind PBPs und CDI intensiv untersuchte Themen, für die PBPs von C. difficile gibt es jedoch nur sehr wenig Forschung. Diese Studie trägt dazu bei, die molekulare Grundlage für die Cephalosporin-Resistenz bei C. difficile und die mit diesen Antibiotika verbundenen hohen Risikofaktoren abzugrenzen. Genauer gesagt zeigen wir, dass PBP1 und PBP2 von C. difficile durch die meisten Cephalosporine nur schwach gehemmt werden, was zu einer geringeren antibakteriellen Aktivität führt. Die Unempfindlichkeit von C. difficile gegenüber Cephalosporinen, gepaart mit der Breitbandaktivität gegen Darmbakterien, tragen zu dem außergewöhnlich hohen Odds-Ratio bei, das mit dieser Klasse von Antibiotika verbunden ist. Unsere Entdeckung einer neuen Gruppe von Zn2+-bindenden PBPs bietet weitere Einblicke in die Zn2+-Abhängigkeit von C. difficile und identifiziert gleichzeitig ein neues Motiv, das in einer Vielzahl von Bakterien vorhanden ist. Insgesamt führt die Charakterisierung dieser PBPs zu neuen und wichtigen Fragen über die Rolle und Regulierung dieser PBPs, ihre neuen Domänen und das Zn2+-Bindungsmotiv in Bezug auf vegetatives Zellwachstum, Teilung und Sporogenese in diesem einzigartigen Pathogen. Die Bewertung ihrer Hemmprofile, relativen Wesentlichkeit und Kristallstrukturen bietet auch einen strukturellen Rahmen für die zukünftige Entdeckung von Antibiotika gegen C. difficile, insbesondere angesichts der jüngsten Fortschritte bei neuartigen chemischen Nicht-β-Lactam-Gerüsten als PBP-Inhibitoren42.

Die kodierende Sequenz, die der TPase-Domäne (376–765) von PBP1 (CDR20291_0712), den löslichen Konstrukten von PBP3 (CDR20291_1067), Ldt2 (CDR20291_2601), Ldt3 (CDR20291_2843), PBP2 (CDR20291_0985), SpoVD (CDR20) entspricht 291_2544) und die Kristallisationskonstrukte von PBP2 (CDR20291_0985) und PBP3 (CDR20291_1067) wurden aus genomischer C. difficile R20291-DNA10 amplifiziert. Die lösliche Sequenz von BSU_15170 (BsSpoVD) wurde aus der genomischen DNA des B. subtilis-Stammes 16843 amplifiziert. Der Expressionsvektor wurde aus pETGST modifiziert, in dem die Thrombin-Spaltungsstelle durch TEV (genannt pETGSTTEV) oder ULP1 (genannt pETGSTSUMO) ersetzt wurde. Spaltungsstelle. Der Vektor wurde verdaut und die PCR-Fragmente für jedes Protein entsprechend in die Multiklonstelle eingefügt. Das PBP1 (376–765) PCR-Fragment wurde durch die Primer 5'GGTCGCTAGCTCTTCATCTGTAGAAGACCTTATCGAAAGTG und 5'GGTCAAAAGCTTTTAATTTTTAGGAACTTCAAATTCAGTAACCGTTAA erhalten und in die NheI/HindIII-Stelle eingefügt; PBP2 36–962-Fragment (5'GGTCGCTAGCTATGAATATTACAATGAGTTAGCTGAGAATAAAAC und 5'GGTCAACTCGAGTTATAATCCCATATAAGTTCCAATAACTTCTC) und Ldt2-Fragment (5'GGTCGCTAGCAAA CATGTGATTATAGTAAATTCAAGAAAAAATAC und 5'GGTCAACTCGAGTTATTTTGCAAGAATATCCAT TAATTTATCCATTAC) wurden in Nhe eingefügt I/XhoI-Sites; Das Ldt3-Fragment (5'GGTCAACATATGAGAGGATGG ATATGTGTGAAATTAACTAAAC und 5'GGTCAACTCGAGTTAATGAATTATAACTGTTGTTGTATCTGG) und das PBP3 42-554-Fragment (5'GGTCAACATATGGGTGAT AAATACAAAACAAAGTGTTGAATCA und 5'GGTCAACTCGAGTTATTTTATACTTTCACATATTTCCTTAAA TATAGG) wurden in den N eingefügt deI/XhoI-Site. Das SpovD 38-583-Fragment (5'GGTCGCTAGCGGAAATTGGTTGAGTACA AAAGCACTAGAAC und 5'GGTCAACTCGAGTTATGGTTTAACTCCCAAATATTTTAAAGAGTC) wurde in die NheI/XhoI-Stelle des pETGSTSUMO-Vektors eingefügt. PBP2 D515N- und C551S-Mutanten wurden mit dem QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) erzeugt. Der klonierte Vektor wurde dann in BL21(DE3) pLysS E. coli transformiert. Standard-Übernachtkulturen wurden in LB-Medien, die Chloramphenicol und Kanamycin enthielten, gezüchtet und zum Animpfen von 1-Liter-LB-Kulturen verwendet. Um die Identität des Metallions im aktiven Zentrum von PBP2 zu untersuchen, wurden M9-Minimalmedien, ergänzt mit 15 µM ZnSO4 oder CuCl2, verwendet, um zwei spezielle Versionen des PBP2-Proteins herzustellen. Die Kulturen wurden gezüchtet, bis die optische Dichte (OD600) ~0,7 erreichte. Anschließend wurde die Proteinexpression mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) über Nacht bei 20 °C induziert. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 4000 × g und 4 ° C geerntet. Das Zellpellet wurde mit einer Lösung aus 20 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl, 20 mM Imidazol und einer gelösten Thermo Scientific™ Pierce Protease-Inhibitor-Tablette suspendiert. Die Zellen wurden mit einem Ultraschallgerät unter Verwendung eines 10-s-Beschallungs-/15-s-Ruhezyklus für 15 Minuten lysiert. Das Zelllysat wurde 35 Minuten lang bei 45.000 × g zentrifugiert und der Überstand auf eine HisTrap HP-Affinitätssäule (GE Healthcare) geladen. Ein linearer Gradient von Puffer B (20 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol und 10 % Glycerin) wurde angewendet, um das rekombinante Protein zu eluieren, was normalerweise bei 30 % Puffer B erfolgte. Diese Fraktionen wurden gepoolt und gepuffert dreimal in Proteasepuffer (20 mM Tris pH 8,0, 10 % Glycerin) unter Verwendung eines Amicon Ultra-Zentrifugalfilters (Sigma-Aldrich) ausgetauscht. Gereinigte His6-markierte TEV-Protease wurde allen Proteinen im Verhältnis 1:20 zugesetzt (außer SpoVD) und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Reine His6-markierte ULP1-Protease wurde im Verhältnis 1:20 zu SpoVD gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Das verdaute Protein wurde erneut auf die HisTrap HP-Affinitätssäule geladen. Der Durchfluss wurde gesammelt, konzentriert und auf eine HiLoad 16/60 Superdex 75-Größenausschlusssäule (GE Healthcare) geladen, wo er mit einer Flussrate von 0,5 ml/min in 20 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl lief. Peak-Fraktionen wurden kombiniert und die Reinheit (>95 %) mittels Gelelektrophorese bestimmt. Die Identität jedes Enzyms wurde anschließend mittels Gelelektrophorese, nativer Massenspektrometrie, Bocillin- oder Nitrocefinbindung und/oder Röntgenkristallographie charakterisiert.

8 mg/ml PBP2 wurden mit 1 mM Ampicillin 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Kristalle wurden durch Mischen von 1,5 µL der Protein- und Inhibitorlösung mit 1,5 µL der Well-Lösung gezüchtet: 15 % PEG 4000, 0,2 M Ammoniumsulfat und 0,1 M Natriumcitrat, pH 5,6. Deckgläser mit den Tropfen wurden versiegelt und eine Woche lang bei 20 °C über 1 ml Welllösung äquilibriert, wodurch viele plättchenförmige Kristalle entstanden. Diese Kristalle wurden dann zu Samen zerkleinert. Diese Methode wurde wiederholt, aber anstatt das Well-Material mit Protein zu vermischen, wurde verdünntes Impfmaterial verwendet, um die Keimbildungsrate zu steuern, was zu Kristallen in Beugungsqualität führte. Die Kristalle wurden dann kurz in einer Kryoschutzlösung aus 30 % PEG 4000, 0,2 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Natriumacetat pH 5,6, 15 % Glycerin eingeweicht und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Überraschenderweise kristallisierte PBP3 leicht unter den gleichen Bedingungen wie PBP2 (15 % PEG 4000, 0,2 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Natriumcitrat, pH 5,6). Allerdings reagierten sie sehr empfindlich auf Glycerin in der Kälteschutzlösung. Um dieses Problem anzugehen, wurden Kristalle zu Keimen zerkleinert und in der mit 5 % Glycerin ergänzten Kristallisationslösung verdünnt. Kristalle wurden durch Mischen von 12 mg/ml Protein mit der mit 5 % Glycerin verdünnten Samenlösung nachgewachsen. Nachdem sie innerhalb einer Woche ihre volle Größe erreicht hatten, wurden 2 µL einer Kryoschutzlösung mit 25 % PEG 4000 und 30 % Glycerin etwa 20 Sekunden lang direkt zu den Tropfen gegeben und die Kristalle wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Röntgenbeugungsdaten wurden an den Strahllinien des Structural Biology Center (SBC) 19-ID und des Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) 22-ID an der Advanced Photon Source in Argonne, IL gesammelt und mit den CCP4-Versionen verarbeitet und skaliert von iMosflm und Aimless44,45,46. Die Auflösung wurde abgeschnitten, wenn die folgenden Kriterien erfüllt waren: Gesamt-Rmerge ≤ 10 %, Außenhülle i/σi ≥ 2 und Vollständigkeit der Außenhülle ≥ 80 %. Erste Modelle wurden mit dem MoRDa-Paket der Online-CCP4-Suite47 erhalten. Die Modelle wurden dann mit PHENIX Autobuild48,49 verarbeitet. Ungelöste Regionen wurden manuell mit einem Polyalanin-Rückgrat unter Verwendung von COOT verfolgt und mit Refmac550,51 verfeinert. Mithilfe der Sekundärstruktur-Vorhersagesoftware PSIPRED52 wurden zunächst α-Helices durch Verfolgen der Elektronendichtekarte erzeugt und sperrige, aromatische Seitenketten wie Tryptophan in ihre entsprechenden Positionen eingepasst. Dies ermöglichte es uns, die Reihenfolge benachbarter Reste zu lösen. Es wurden Iterationen generiert, bis einzelne Sidechains aufgelöst werden konnten. Zwei flexible Regionen mit mehrdeutiger Elektronendichte wurden nicht modelliert: 357–370 der NTD und 624–692 der TPase-Domäne. Diese Region in der TPase-Domäne enthält wahrscheinlich drei parallele α-Helices, wir konnten die Dichte jedoch nicht zuverlässig modellieren. Ebenso wurde ein kurzes Segment von 197–216 im NTD für PBP3 nicht modelliert. Alle Strukturbilder wurden mit PyMol (Schrödinger, LLC)53 erstellt. Topologiediagramme wurden mit Hilfe von Pro-origami54 erstellt.

Zinkquantifizierungstests wurden mit einem Fluorometrischen Zinkquantifizierungskit (Abcam) durchgeführt. Das Protein wurde mit dem gleichen Volumen einer 7%igen TCA-Lösung denaturiert und 5 Minuten lang bei 13.000 × g zentrifugiert. Nach der Proteindenaturierung wurden die Überstände mit 1 M Na2CO3 mit 1/10 des Probenvolumens neutralisiert. Die Proben wurden gevortext und 5 Minuten lang auf Eis gehalten, bevor sie für die Reaktion verwendet wurden. Eine 100 µM ZnCl2-Standardlösung wurde hergestellt, um 1:2-Reihenverdünnungen durchzuführen und eine Standardkurve zu erstellen. 50 µL ZnCl2-Standards, vorbereitete Proteinproben und Blindpufferkontrolle wurden in eine optische Bodenplatte aus schwarzem Polystyrol mit 96 Vertiefungen (Thermo Fisher Scientific) gegeben. PBP2 wurde in 2-facher, 5-facher und 10-facher Verdünnung sowie PBP1 als Negativkontrolle und NDM-1 als Positivkontrolle getestet. PBP2 C551S wurde in 2-facher, 5-facher und 10-facher Verdünnung getestet, um die Auswirkung der Mutation auf die Zn2+-Bindung zu testen. 50 µL Zn Detection Assay-Puffer wurden in jede Vertiefung gegeben und 10 Minuten lang inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde bei 485/525 nm (Ex/Em) bei RT unter Verwendung eines BioTek Cytation 5-Plattenlesegeräts (BioTek Instruments) gemessen.

Die Reaktionen wurden in einer 96-Well-Polystyrolplatte mit einem Endvolumen von 60 μl bei 37 °C in 1X Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM Tris, 150 mM NaCl) durchgeführt. Für die IC50-Werte wurde der Inhibitor seriell mit einem Zweifachschema verdünnt, sodass die höchste Konzentration einen Endwert von 1 mM oder 500 µM hatte und die Endkonzentration entweder 0,97 µM oder 0,49 µM betrug. Einzelkonzentrationsscreens wurden bei 25 µM durchgeführt. Anschließend wurde das Protein verdünnt und bis zu einer Endkonzentration von 1 µM in die Vertiefung gegeben und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. 1 µL Bocillin (BOCILLIN™ FL Penicillin, Natriumsalz, Thermo Fisher Scientific) wurde in jede Vertiefung gegeben, bis eine Endkonzentration von 20 µM erreicht war, und 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 10 µL 6X SDS-Ladepuffer abgetötet und gepoolt oder direkt auf ein Novex Wedgewell 8 % Tris-Glycin-Gel mit 15 Vertiefungen (Thermo Fisher Scientific) geladen und etwa 1 Stunde lang bei 175 V betrieben. Anschließend wurden die Gele mit einem Gel Doc XR + Imager (Bio-Rad Laboratories) 6 s lang mit der Fluorescein-Blot-Filtereinstellung abgebildet und mit ImageJ55 analysiert. Alle Werte wurden auf die Hintergrundintensität normiert und durch den Durchschnitt von drei Kontrollintensitäten (kein Inhibitor) dividiert, um den prozentualen Hemmwert zu ermitteln. Die Tests wurden in doppelter oder dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die IC50-Werte wurden mit Graphpad Prism mit einer 4-Parameter-Logistikanpassung berechnet. Unverarbeitete Gele für ergänzende Abbildungen. 1 und 6d sind in den Quelldaten enthalten.

Die Reaktionen wurden in einer Polystyrolplatte mit 96 Vertiefungen und einem Endvolumen von 60 μl bei 37 °C in 20 mM Tris, pH 7, 200 mM NaCl durchgeführt. Die Inhibitoren wurden auf eine Endkonzentration von 25 µM verdünnt. Dann wurde Protein in einer Endkonzentration von 1 µM in die Vertiefung gegeben und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde 1 µL Nitrocefin (Millipore Sigma) in jede Vertiefung gegeben, um eine Endkonzentration von 20 µM zu erreichen, und der Reaktionsfortschritt wurde mit einem BioTek Cytation 5-Plattenlesegerät (BioTek Instruments) bei 488 nm und 37 °C 1 Stunde lang überwacht. Die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden für die prozentualen Hemmungswerte auf die Kontrolle (kein Inhibitor) normalisiert. Die Tests wurden doppelt durchgeführt und die mittleren prozentualen Hemmwerte wurden berechnet.

Die thermischen Verschiebungstests wurden mithilfe der Differentialscanning-Fluorometrie durchgeführt. Gereinigtes Protein wurde in TBS verdünnt und mit SYPRO™ Orange (Invitrogen) kombiniert, um eine Endproteinkonzentration von 3 µM und eine Endkonzentration von SYPRO™ Orange von 1X zu erreichen, mit einem Endvolumen von 20 µL. Die Fluoreszenz wurde mit dem Applied Biosystems® 7900HT Fast Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) von 25 °C bis 99 °C mit einem Rampenschritt von 0,3 °C gemessen. Die Schmelztemperaturwerte wurden durch Anpassen sigmoidaler Fluoreszenzintensitätskurven mit einer 4-Parameter-Logistikanpassung bestimmt.

Die MHK von Antibiotika gegen den C. difficile-Stamm R20291 wurden wie zuvor beschrieben56 bestimmt. Den Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die R20291-Kulturen enthielten, wurden Antibiotika in einer Dichte von 0,5 McFarland (100 µL pro Vertiefung) in BHI-Medium zugesetzt, um Endkonzentrationen an Antibiotika im Bereich von 128 µg/ml bis 0,5 µg/ml bei einer Verdoppelung zu erreichen Verdünnung. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die MHK wurde als die niedrigste Konzentration bestimmt, die das Bakterienwachstum in den Vertiefungen vollständig hemmt. Die MHK-Bestimmung wurde dreimal wiederholt.

Sporulationstests wurden wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Änderungen durchgeführt57,58,59. Kurz gesagt, C. difficile R20291-Zellen wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase in BHIS-Medium, ergänzt mit 0,1 % Taurocholat (Sigma), bei 37 °C in einer anaeroben Kammer kultiviert. Eine Mischung aus 70:30 Sporulationsmedium (70 % SMC-Medium und 30 % BHIS-Medium, enthaltend 63 g Bactopepton, 3,5 g Proteasepepton, 11,1 g BHI-Medium, 1,5 g Hefeextrakt, 1,06 g Tris-Base, 0,7 g Ammoniumsulfat und 15 g Agar pro Liter) hergestellt. Anschließend wurden die Kulturen auf eine optische Dichte von 0,5 bei OD600 verdünnt, dann wurden 150 µl R20291-Kulturen in Gegenwart/Abwesenheit von Calprotectin bei 10 μg/ml oder TPEN bei 12,5 μM oder ZnCl2 bei 15 μM über die Oberfläche eines 70: 30 mittelgroße Agarplatten. Ungefähr 24 Stunden nach Beginn der stationären Phase (T24) wurden C. difficile-Zellen mit einer sterilen Impföse von der Oberfläche der Platte abgekratzt und in ~5 ml BHIS auf eine OD600 = ~1,0 suspendiert. Um die ethanolresistente Sporenbildung zu beurteilen, wurden 500 µL Proben aus dem Sporulationsmedium aus der anaeroben Kammer entnommen und 15 Minuten lang 1:1 mit 95 % Ethanol gemischt, um vegetative Zellen abzutöten. Die Proben wurden dann in die anaerobe Kammer zurückgebracht, 100 µl der mit Ethanol behandelten Kulturen wurden mit 100 µl 10 % Taurocholat gemischt und die Mischungen wurden auf BHIS-Agar ausplattiert, um die Keimung der C. difficile-Sporen zu induzieren. Der ethanolresistente KBE/ml wurde nach 24-stündiger Inkubation bestimmt und durch den Gesamt-KBE/ml der nicht mit Ethanol behandelten Kulturen dividiert. Es wurden vier biologische Replikate durchgeführt.

Um die gemeinsamen Proteindomänenfamilien auf die Entdeckung von Mustern ortsspezifischer evolutionärer Konservierung im Zusammenhang mit Zn2+-bindenden PBPs zu untersuchen, wurden Profil-Hidden-Markov-Modelle (Profil-HMMs) für probabilistische Domänensuchen erstellt60. HMMER (v.3.3.2)61 verwendet Ensemble-Algorithmen, um alle möglichen Sequenzausrichtungen zu berücksichtigen, jeweils gewichtet nach der Wahrscheinlichkeit positiver Ergebnisse. Die als Eingabe verwendeten Sequenzen sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt. Als Ziele für die Suche wurden die Datenbanken von UniProtKB und SwissProt verwendet. Für die phylogenetische Analyse wurde eine Reihe der repräsentativsten „Samen“-Sequenzen aus der Superfamilie mit über 200.000 Mitgliedern ausgewählt. Die phylogenetisch unterschiedlichen Domänen der DD-Transpeptidase (PF00905) wurden zur Analyse der Evolutionsmuster verwendet.

Alle Proteine wurden wie zuvor beschrieben mit Bio-Spin P-6 Size Exclusion Spin Columns (BioRad) in 0,2 M Ammoniumacetat gepuffert62. Native MS wurde unter Verwendung eines Q-Exactive HF-Quadrupol-Massenspektrometers mit Forschungsmodifikationen für den Ultra-High-Mass-Range (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Alle Proteine wurden mittels Nano-Elektrospray-Ionisation im positiven Modus mit einer Sprühspannung von 1,1–1,5 kV bei 200 °C ionisiert. Die Proben wurden mit einem Bereich von 2.000–15.000 m/z analysiert und die Auflösung wurde auf 15.000 eingestellt. Das Einfanggas wurde für alle Proben auf 5 eingestellt und in der Quelle wurden 50 V angelegt, um die Desolvatisierung zu unterstützen. Die Daten wurden mit UniDec63 entfaltet und analysiert.

Eine Reihe von Verdünnungen von PBP2 oder PBP3, ausgedrückt in reichhaltigem (LB) oder minimalem Medium, ergänzt mit ZnSO4−7H2O, wurde in 20 mM Tris, pH = 8,0, 200 mM NaCl hergestellt, um einen Konzentrationsbereich von 0,2–8,25 μM abzudecken. Diese Verdünnungen wurden im USF Center for Geochemical Analysis auf einem Perkin Elmer Nexion 2000P Quadrupol ICP-MS im He-Kollisionsmodus durchgeführt, um NaAr-Interferenzen durch den NaCl-Puffer und durch Sulfat bei den Massen 63, 64 bzw. 66 zu minimieren. Die Bedingungen am ICP-MS waren wie folgt: Die HF-Leistung wurde auf 1600 W mit einem Zerstäuberfluss von 1,02 ml/min festgelegt. Hilfs- und Plasmagasströme wurden auf 1,2 bzw. 15 ml/min eingestellt und die Pumpengeschwindigkeit wurde auf 18 U/min eingestellt, was der Sprühkammer etwa 0,3 ml/min Probe zuführt. Der Ablehnungsparameter für die Interferenz wurde auf 0,45 eingestellt. Diese Einstellung reduziert die Zählraten erheblich, minimiert aber auch die Leerstelle, was zu einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis führt. Der niedrigste Standard lag bei 0,8 μg/L, was für 65Cu und 64Zn, 66Zn und 68Zn zwischen dem 3- und 10-fachen des Hintergrunds lag. Wir haben uns entschieden, die Daten für 63Cu zu verwerfen, da die Konzentrationen für in der Pufferlösung vorbereitete Proben immer noch ungewöhnlich hoch waren, was wahrscheinlich auf einen sehr hohen Na-Gehalt im Puffer und damit auf eine NaAr-Interferenz bei der Masse 63 zurückzuführen ist.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Alle Kristallstrukturen wurden in der RCSB Protein Data Bank (PDB) mit den Zugangs-IDs hinterlegt: C. difficile PBP2 + Ampicillin (PDB ID 7RCW), ungebundenes PBP2 (PDB ID 7RCX), PBP2 + Ceftobiprol (PDB ID 7RCY), SpoVD + Ampicillin (PDB-ID 7RCZ) und ungebundenes PBP3 (PDB-ID 7RD0). Rohe Röntgendaten sind auf Anfrage erhältlich. Alle Proteinsequenzdaten sind unter https://www.uniprot.org/ und https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ frei zugänglich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Sean Crosson, Phoebe Rice und Gloria Ferreira für ihre Beratung. Wir danken auch den Mitarbeitern der Advanced Photon Source des Argonne National Laboratory, insbesondere denen des Structural Biology Center (SBC) und des Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT), für ihre Unterstützung bei der Sammlung von Röntgenbeugungsdaten. SBC-CAT wird von UChicago Argonne LLC für das US Department of Energy, Office of Biological and Environmental Research unter dem Vertrag DE-AC02-06CH11357 betrieben. Der Einsatz von Strahllinien bei SER-CAT wurde von seinen Mitgliedsinstitutionen und Ausrüstungszuschüssen (Grants S10_RR25528 und S10_RR028976) vom NIH unterstützt. Diese Arbeit wurde vom NIH unterstützt (R21 AI147654 und R01 AI161762 an YC, R01 AI132711 an XS, R35 GM128624 an MTM, R35 GM133617 an PJE). JAT wurde von T32 GM008804 unterstützt.

Abteilung für Molekulare Medizin, Morsani College of Medicine, University of South Florida, Tampa, FL, 33612, USA

Michael D. Sacco, Shaohui Wang, Xiujun Zhang, Eric M. Lewandowski, Maura V. Gongora, Jean R. Gatdula, Ryan T. Morgan, Xingmin Sun und Yu Chen

Department of Global and Planetary Health, USF Genomics Program, Global Health and Infectious Disease Center, College of Public Health, University of South Florida, Tampa, FL, 33620, USA

Swamy R. Adapa & Rays HY Jiang

Fakultät für Chemie, University of South Florida, Tampa, FL, 33620, USA

Dimitra Keramisanou & Ioannis Gelis

School of Geosciences, University of South Florida, Tampa, FL, 33620, USA

Zachary D. Atlas

Abteilung für Chemie und Biochemie, The University of Arizona, Tucson, AZ, 85721, USA

Julia A. Townsend und Michael T. Marty

Abteilung für Zellbiologie, Mikrobiologie und Molekularbiologie, University of South Florida, Tampa, FL, 33620, USA

Lauren R. Hammond & Prathees J. Eswara

Abteilung für Medizinische Chemie, Ernest Mario School of Pharmacy, Rutgers, State University of New Jersey, Piscataway, NJ, 08854, USA

Juni Wang

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Die hier vorgestellten Studien wurden von MDS, XS und YC konzipiert und gestaltet; Das Manuskript wurde von MDS und YC unter Mitwirkung anderer verfasst; JW, MTM, PJE, IG, RJ, XS und YC lieferten wissenschaftlichen Input, finanzierten und überwachten die Studien; Die Zahlen wurden von MDS mit Beiträgen anderer erstellt; Proteinkonstrukte wurden von MDS und YC entworfen; LRH unterstützte die Experimente mit B. subtilis SpoVD, einschließlich seiner Klonierung mit Input von PJE. Proteine wurden von XZ geklont und gereinigt; Biochemische und thermische Verschiebungsbindungstests wurden von MDS durchgeführt; Kristallisationsexperimente wurden von MDS mit Hilfe von MVG und JRG durchgeführt; Kristallstrukturen wurden von MDS mit Hilfe von EML gelöst und verfeinert; Der Zinkquantifizierungstest wurde mit RTM durchgeführt; JAT führte unter Anleitung von MTM Experimente zur nativen Massenspektrometrie durch; IG und ZDA führten ICP-MS-Messungen durch; DK und IG analysierten ICP-MS-Daten; RJ und SRA führten eine phylogenetische Analyse durch und erstellten Abb. 5; MHK- und Sporulationstests wurden von SW durchgeführt

Korrespondenz mit Xingmin Sun oder Yu Chen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Michel Arthur, Carlos Contreras-Martel und Daniel Paredes-Sabja für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sacco, MD, Wang, S., Adapa, SR et al. Eine einzigartige Klasse von Zn2+-bindenden PBPs auf Serinbasis liegt der Cephalosporinresistenz und Sporogenese bei Clostridioides difficile zugrunde. Nat Commun 13, 4370 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32086-6

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Eingegangen: 07. Januar 2022

Angenommen: 18. Juli 2022

Veröffentlicht: 28. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32086-6

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